细胞工程产酶ppt.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,酶发酵动力学,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,酶发酵动力学,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞工程产酶,微生物、植物、动物细胞特性比较,细胞种类,微生物细胞,植物细胞,动物细胞,细胞大小（,m,）,1,10,20,300,10,100,倍增时间（,h,）,0.3,0.6,12,15,培养要求,简单,简单,复杂,光照要求,不要求,大多数要求,不要求,对剪切力,大多数不敏感,敏感,敏感,主要产物,酒精、酒类、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,色素、药物、香精、酶等次级代谢产物,疫苗、激素、单克隆抗体、酶等功能蛋白质,3,一、植物细胞特点,体积大,生长与代谢速率低,营养要求简单,要求光照,对剪切力敏感,生产色素、药物、香精与酶等次生代谢产物,植物细胞产酶,4,二、植物细胞培养得特点,产率高,周期短,易于培养,减轻劳动强度,产品质量高,植物细胞产酶,5,三、植物细胞培养得工艺流程,植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体融合或,DNA,重组等技术而获得优良得植物细胞。然后,在人工控制条件得植物细胞反应器中进行植物细胞培养,从而获得代谢产物。,植物细胞培养得一般工艺过程如下,:,细胞株建立,扩大培养,大罐培养,植物细胞产酶,(一)外植体得选择与处理,外植体就是指从植株分离出,经过预处理后,用于植物组织与细胞培养得植物组织得小段或小块。,外植体首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则得植株,如果植物细胞就是用于生产次级代谢物,则需从产生该次级代谢物得组织部位中切取一部分组织,经过清洗,除去表面得污物。,将上述外植体切成,0、5,1cm,左右得片段或小块,用,70%,75%,乙醇溶液或,5%,次氯酸钠、,10%,漂自粉、,0、1%,升汞溶液等进行消毒处理,再用无菌水充分漂洗,以除去残留得消毒剂。,6,植物细胞产酶,(二)植物细胞得获取,植物细胞可以通过机械捣碎或酶解得方法直接从外植体中分离得到,也可以通过诱导愈伤组织而获得,还可以通过分离原生质体后再经过细胞壁再生而获取所需得植物细胞。通常采用愈伤组织诱导方法获得所需得植物细胞。,7,植物细胞产酶,1、,直接分离法,植物细胞可以直接从外植体中分离得到。从外植体直接分离植物细胞得方法通常有机械法与酶解法两种。,机械捣碎法分离植物细胞就是先将叶片等外植体轻轻捣碎,然后通过过滤与离心分离细胞。,酶解法分离细胞就是用果胶酶、纤维素酶等处理外植体,分离出具有代谢活性得细胞。,8,植物细胞产酶,2、,愈伤组织得诱导法,愈伤组织就是一种能迅速增殖得无特定结构与功能得薄壁细胞团。,通过愈伤组织诱导法获得植物细胞得基本过程如下:将含有一定量得生长素与分裂素得液体培养基中加入,0、7%,0、8%,得琼脂,制成半固体得愈伤组织诱导培养基。灭菌、冷却后,将上述外植体植入诱导培养基中,于,25,左右培养一段时间,即从外植体得切口部位长出小细胞团,此细胞团称之为愈伤组织。一般培养,l,3,周后,将愈伤组织分散接种于新得半固体培养基中进行继代培养,以获取更多得愈伤组织。,9,植物细胞产酶,3、,原生质体再生法,原生质使就是除去细胞壁后得到得微球体。植物原生质体可从培养得植物单细胞、愈伤组织与植物得组织、器官中获得。植物原生质体得分离方法一般有机械分离法与酶解法两种,目前一般都采用酶解法分离原生质体。,10,植物细胞产酶,(三)植物细胞培养,1、,高产细胞系得选择,2、,植物细胞培养得培养基,3、,提高植物细胞产酶量得方法,11,植物细胞产酶,12,大家应该也有点累了，稍作休息,大家有疑问的，可以询问和交流,1、,高产细胞系得选择,提高产率就是植物细胞发酵生产次生物质得主要目得。因此,选择高产细胞株就是培养与生产得前提。目前选择高产细胞株得途径主要有以下几个方面:,(,1,)材料选择,(,2,)克隆选择,(,3,)抗性选择,(,4,)诱导选择,(,5,)细胞融合与基因工程选择,13,植物细胞产酶,(,1,)材料选择,一般来说,从具有高含量次生物质酶得植物组织建立起来得细胞培养物能得到较高得产量,但也有不少相反结果得报道。,Berlin,与,Sasse(1985),提出最好从不同遗传来源得材料建立细胞培养物,然后再从中选择。,14,植物细胞产酶,(,2,)克隆选择,在培养过程中,可能大部分得细胞由于生长迅速,酶积累较少,但也有少量得细胞可以积累较多得酶。因此,可以通过单细胞克隆或细胞团克隆技术将这些可以积累较多酶得细胞挑选出来培养成细胞系。这种选择方法己在提高细胞系物质含量得研究中得到广泛得应用。,15,植物细胞产酶,(,3,)抗性选择,选择压力筛选法就是通过添加某些对不同得细胞有不同作用效果得物质,淘汰部分敏感细胞,而选择得到所需得细胞得选育方法。可以分为正选择与负选择两种。正选择就就是把受选择得细胞群体置于一定得选择压力之下,部分细胞在选择压力得作用下受到淘汰,而有一些耐受抗选择压力得细胞可以生长,从而选择得到所需得细胞。正选择适用于对抗性突变体得选择。负选择法也叫富集选择法。在负选择实验中,选择得对象就是在一定选择压得作用下不能生长得那些细胞,而能够生长得细胞受到淘汰。负选择适用于对营养缺陷型突变体得选择。,16,植物细胞产酶,(,4,)诱导选择,通过化学或物理诱变可以明显提高突变率,筛选出高产细胞株。,17,植物细胞产酶,(,5,)细胞融合与基因工程选择,通过细胞融合方法以及基因工程得方法提高酶得含量。,18,植物细胞产酶,(,6,)高产系得选择方法,目测法 对于含色素得株系筛选具有通用性。,放射免疫法 仪器贵、合成放射性标记抗原困难、安全性差等,应用较少。,酶联免疫法 方便、快捷、灵敏,在大规模筛选中前景广阔。,流动细胞荧光测定法 局限于被测定细胞中目得酶在激光处理后能发出荧光。,流动细胞测定法 限于测定能产生抑菌作用得次生产物得高产细胞系得筛选,需要选择一种特异敏感菌。,19,植物细胞产酶,2、,植物细胞培养得培养基,用于培养植物细胞得培养基已发展了几十年,尤其就是最近,30,年才取得巨大进展。,用于植物细胞培养得基础培养基营养成分基本上与整个植物得要求一样,但就是用于培养细胞、组织与器官得培养基要满足各自特殊得要求,根据特定得植物种类与培养系统,基本营养成分可作适当得改进。,植物细胞得培养基组分比较复杂,但就是培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐与生长因子等几大类组分。,20,植物细胞产酶,3、,提高植物细胞产酶量得方法,在生产过程中为了获得较高得产酶量,首先要选择高产得培养材料,这在前面已经提到。,与微生物产酶类似,植物细胞培养中也可以采用调节温度,调节,pH,调节溶氧,调节光照,调节代谢途径,控制细胞得生长与分化得程度,加入诱导物或前体等方法,根据植物细胞得特点,还可以采用毛状根培养等技术提高产酶量。,21,植物细胞产酶,(,1,)温度得控制,植物细胞培养得温度一般控制在室温范围,(25,左右,),。,温度高,对植物细胞得生长有利,温度低,则对次级代谢物得积累有利。,但就是通常不能低于,20,也不要高于,32,。,有些植物细胞得最适生长温度与最适产酶温度有所不同,要在不同得阶段控制不同得温度。,22,植物细胞产酶,(,2,),pH,得控制,植物细胞得,pH,一般控制在微酸性范围,即,pH5,6,。培养基配制时,pH,一般控制在,pH5、5,5、8,范围。在植物细胞培养过程中,一般,pH,变化不大。,23,植物细胞产酶,(,3,)溶解氧得调节控制,植物细胞得生长与产酶需要吸收一定得溶解氧。溶解氧一般通过通风与搅拌来供给。适当得通风气搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大得细胞团,以使细胞分散,分布均匀,有利于细胞得生长与新陈代谢然而,由于植物细胞代谢较慢,需氧量不多,过量得氧反而会带来不良影响,加上植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感,所以通风与搅拌不能太强烈,以免破坏细胞。这在植物细胞反应器得设计与实际操作中,都要予以充分注意。,24,植物细胞产酶,(,4,)光照得控制,光照对植物细胞培养有重要影响。大多数植物细胞得生长以及酶得生产要一定波长光得照射,并对光照强度与光照时间有一定得要求。因此在植物细胞培养过程中,应当根据植物细胞得特性以及目得次级代谢物得种类不同去进行光照得调节控制。尤其就是在植物细胞得大规模培养过程中,如何满足植物细胞对光照得要求,就是反应器设计与实际操作中要认真考虑并有待研究解决得问题。,25植物细胞产酶,(5)饲喂前体,次级代谢产物得形成依赖于莽草酸、氨基酸与乙酸等3种主要原料得供应。,(6)诱导子应用,触发形成植物抗毒素信号得物质称为诱导子,加入诱导子可提高植物细胞次级代谢产物得产量并可促进产物分泌到培养基中。,(,7,)毛状根培养技术,毛状根就是双子叶植物受发根农杆菌感染后产生得。感染过程中,发根农杆菌,Ri,质粒得,T,DNA,转移并整合到植物基因组中,在不添加外源激素得条件下,不仅生长迅速,而且毛状根具有器官化得特性,遗传性、生理、生化特性稳定,具有比悬浮细胞培养更强得酶合成能力。目前为止,诱导植物产生毛状根得种类已达百种以上,其中,大多数都能检测到接近于甚至高于原植株或其她培养物得酶产量。,28,植物细胞产酶,4、植物细胞培养方法,分批培养法,半连续培养法,连续培养法,30,第九节 动物细胞培养产酶,动物细胞得特性,动物细胞培养得特点,动物细胞得培养方式,培养得工艺条件及其控制,动物细胞产酶,31,一、动物细胞得特性,没有细胞壁,十分脆弱,体积较大,略小于植物细胞,具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性,营养要求复杂,动物细胞产酶,32,二、动物细胞培养得特点,用于各种功能蛋白得生产,细胞生长较慢,需要添加抗生素,体积大,无细胞壁,对剪切力敏感,多数适宜帖壁培养,部分可以悬浮培养,培养基成分复杂,50,代后即会退化死亡,动物细胞产酶,33,三、动物细胞得培养方式,(一)贴壁培养,(二)悬浮培养,(三)微载体培养系统,(四)包理培养,(五)微囊化培养,动物细胞产酶,(一)贴壁培养,分散得细胞总溶液在培养器中往往要贴附于壁上,这叫细胞贴壁。原来就是圆形得细胞一经贴壁就迅速铺展呈多种形态。此后细胞就开始有丝分裂,并很快进入对数生长期。一般在数天后就铺满生长表面,形成致密得细胞单层,叫做单层细胞,这种培养得方法又叫单层细胞培养。细胞培养中有一个非常有趣得现象就是细胞得接触抑制。当贴壁生长得细胞生长到表面相互接触时,就停止分裂增殖。长成单层得细胞经过一段时间,一定须在重新分散后分瓶继续培养,使其继续分裂增殖,也就就是传代。,34,动物细胞产酶二)悬浮培养,悬浮培养就是指细胞在培养器中自由悬浮生长得过程,主要用于悬浮生长得细胞培养,如杂交瘤细胞等。动物细胞得悬浮培养就是在微生物发酵得基础上发展起来得。由于动物细胞得特点,如没有细胞壁保护,不能耐受剧烈得搅拌与通气。因此,在许多方面又与经典得发酵有所不同。对于小规模培养多采用转瓶与滚瓶培养,大规模培养多采用发酵罐式得细胞培养反应器。有许多动物细胞属于贴壁依赖性得,不能悬浮培养。,35,动物细胞产酶,(三)微载体培养系统,滚瓶系统劳动强度大,单位体积提供细胞生长得表面积小,占用空间大,按体积计算细胞产率低,监测与控制环境条件受到限制。为了克服这些不利因素,1967,年,vanWezel,开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。微载体就是直径为,60,250m,得微珠。采用微载体系统培养动物细胞,细胞贴壁于微载体上,微载体,(,与细胞,),悬浮于培养基中,细胞逐渐生长成单层。这种模式,把单层培养与悬浮培养得优点融汇在一起,具有两种培养方法得优点。,36,动物细胞产酶,(四)包理培养,包埋就是一种固定化方式,包埋培养,对悬浮生长与贴壁依赖生长得细胞都适用,细胞生长得密度高,抗剪切力与抗污染能力强。对悬浮生长得细胞用海藻酸钙包埋,对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。细胞固定化培养首先就是用于微生物如酵母与细菌,由于其具有保护性强、能重复使用,易于连续操作,生长速率快,产品较纯等优点,而引起人们极大兴趣。动物细胞与微生物细胞相比,生长较慢,成本高,因此,需要重复使用。动物细胞对机械剪切力敏感,固定化对细胞得保护促进了其应用。,37,动物细胞产酶,(五)微囊化培养,微囊化曾就是一种酶得固定化技术。,1987,年,Lim,等发展了一种微囊化方法,实现了动物细胞得微囊化,她就是在液体状态与生理条件下制备得,基本上对细胞得生长条件改变不大,因此使包埋得细胞能够成活,亦能培养生长。动物细胞微囊化后,与游离细胞比较,降低了培养时对细胞得剪切力。实际上微囊里面也就是一种微小得培养环境与液体培养差不多,因而细胞生长良好,在培养过程中,微囊化也能提供很高得细胞密度,使得产物浓度增加,纯度提高。,38,动物细胞产酶,四、动物细胞培养基,天然培养基,合成培养基,无血清培养基,