第7章-基因的表达与调控(上).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,概述,一、基因表达的概念,gene expression,：基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为,gene regulation,。,rRNA,、,tRNA,编码基因转录合成,RNA,的过程也属于基因表达。,组成性表达,(constitutive expression),适应性表达,(adaptive expression,）,二、基因表达的方式,1,、组成型表达：,指不大受环境变动而变化的一类基因表达。,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为,管家基因,(housekeeping gene),。,无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为,组成型表达,(constitutive expression),。,2,、空间特异性,(spatial specificity),基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称,细胞或组织特异性,(cell or tissue specificity),。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的,空间特异性,。,四、基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖,（原核、真核）,维持个体发育与分化,（真核）,五、基因表达调控的层次,转录水平,基因结构活化,转录起始（基因表达基本控制点）,转录后水平,转录后加工,转录产物的转运,翻译水平,翻译调控,翻译后加工,蛋白质降解,六、,转录水平,-,基因转录激活调节基本要素,（一）特异,DNA,序列,（二）调节蛋白,（三）,RNA,聚合酶,原核生物的特异,DNA,序列,原核生物基因表达与调控是通过操纵子机制来实现的。,操纵子,是由功能上相关联的多个编码序列（结构基因）及其上游的调控序列成簇串联在一起构成的一个转录协调单位。,调控序列,包括操纵序列,(O),、启动序列,(P),和调节基因,(I/R),等组件。,（一）特异,DNA,序列,操纵子,调节基因 启动序列 操纵序列,编码序列（,结构基因,）,表达,转录,I,CAP,P,O,Z,Y,A,阻遏蛋白,结合部位,RNA,聚合酶,结合部位,启动序列（,P,）：,其中的,-35,区,-10,区,是,RNA,聚合酶识别并结合的部位。,多顺反子,mRNA,阻遏蛋白,（负性调节）正性调节）,多种蛋白质,真核生物的特异,DNA,序列,真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达的特异,DNA,序列，称为顺式作用元件。,顺式作用元件能够被各种转录调节蛋白特异识别和结合，从而影响基因表达活性。,启动子,顺式作用元件又分 增强子,沉默子,1),顺式作用元件,(,cis,-acting element),可影响自身基因表达活性的,DNA,序列,B,A,DNA,编码序列,转录起始点,不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列，如,TATA,盒、,CAAT,盒等，这些共有序列是,RNA,聚合酶或特异转录因子的结合位点。,（二）调节蛋白,原核生物的调节蛋白（,3,类）,特异因子决定,RNA,聚合酶对启动序列的特异识别和结合能力；,(,如，,RNA,聚合酶的,因子,),阻遏蛋白,通过与操纵序列结合，阻遏基因转录，发挥负性调控作用；,（由调节基因表达的阻遏蛋白）,激活蛋白,与启动子上游,DNA,序列结合，促进,RNA,聚合酶转录活性，发挥正性调控作用。,(,如，,CAP,分解代谢物基因活化蛋白,),2.,真核生物的调节蛋白,反式作用因子,能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式（作用）因子。,(,trans,-acting factor),按其功能不同，常有以下三类：,基本转录因子,转录调节因子,共调节因子,（,1,）基本转录因子TF,）,是指能够在启动子部位与核心序列,TATA,盒和,RNA Pol,结合，形成转录前起始复合物（,PIC,）的一类调节蛋白，以起动转录。,与,RNA,聚合酶,(RNA Pol),结合的,(,基本,),转录因子有：,TFA,，,TFB,，,TFD,，,TFE,，,TFF,，,TFH,TFJ,等。,首先由,TFD,与启动子,TATA,盒结合，然后按一定的时空顺序依次结合,RNA Pol,和其它转录因子，形成,PIC,。,(2),转录调节因子,这类调节蛋白能识别并结合转录起始点上游的调控序列或远端的增强子元件，通过蛋白质,-,DNA,相互作用而影响转录活性。,起激活转录作用,转录激活因子；起阻遏转录作用,转录阻遏因子。,（,3,）共调节因子,另有一类与转录调节因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，影响转录活性，称共调节因子。,如果与转录激活因子有协同作用,共激活因子；,与转录阻遏因子有协同作用,共阻遏因子。,7.1,原核基因表达调控总论,7.1.1,原核基因表达调控的类型与特点,1,、根据操纵子对调节蛋白,(,阻遏蛋白或激活蛋白,),的应答，,正转录调控,负转录调控,调节基因,RNA,调节蛋白,调节基因,操纵基因,结构基因,激活蛋白,正转录调控,正转录调控,如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控正转录调控。,调节基因,操纵基因,结构基因,阻遏蛋白,负转录调控,负转录调控,在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。,根据辅因子,(,小分子,),结合后调控效果，可分：,开启调控系统中结构基因的转录活性,诱导,关闭调控系统中结构基因的转录活性,阻遏,操纵子调控系统的基本类型,可诱导负控制系统,可诱导正控制系统,可阻遏负控制系统,可阻遏正控制系统,几个概念：,诱导物,(inducer),：,指当作用于细胞群体时,通过诱导机制、能增加特定基因转录的,mRNA,含量的一种化学因子或物理因子,辅阻遏物,(corepressor,),：,一种能与阻遏蛋白形成功能阻遏物，而使合成代谢的操纵子受到阻遏的代谢终产物。,正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调控又有负调控；原核生物以负调控为主，真核生物以正调控为主；降解代谢途径中既有正调控又有负调控；合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成。,可诱导调节,可阻遏调节,7.1.2,原核基因表达调控的主要特点,7.1.3,弱化子对基因活性的影响,7.1.4,降解物对基因活性的影响,7.1.5,细菌的应急反应,1,、,Discovery of Operon,1961,年,F.Jacob&J.Monod,提出,此后不断完善。,获,1965,年诺贝尔生理学和医学奖,1940,年，,Monod,发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生,细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶,1947,年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”,Francis Jacob,Jacques Monod,7.2,乳糖操纵子与负控诱导系统,1951,年，,Monod,与,Jacob,合作，发现两对基因：,Z,基因,：与合成,-,半乳糖苷酶有关；,I,基因,：决定细胞对诱导物的反应。,Szilard,：,I,基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。,Jacob,：结构基因旁有开关基因（,操纵基因,），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。,操纵子,是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括,调节基因,，,操纵位点,，,结构基因,，组成一个控制单元。,结构基因：,产生,mRNA,合成蛋白质,操纵位点,operator,：启动子结合位点,调节基因：产生调节蛋白,（与操纵位点结合）,结构基因不转录,诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合,结构基因转录,2,、操纵子的定义,7.2.1,酶的诱导,lac,体系受调控的证据,细菌对乳糖的利用及其相关的酶,:,乳糖,(,在通透酶作用下进入细菌）,-,半乳糖苷酶,别构乳糖,-,半乳糖苷酶,葡萄糖,+,半乳糖,-,半乳糖苷乙酰基转移酶,1),lac,操纵子的本底水平,(basal level),表达,有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的：,诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成有需要诱导。,真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在,-,半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有,-,半乳糖甘酶的预先存在。,一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？,一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？,解释：,本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的,lac,mRNA,合成。,分解底物的酶只有在底物存在时才出现！,无乳糖时，几个,b,-gal/cell,加入乳糖时，,5000,个,乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？,培养基（,35,S-aa,无乳糖）,E.coli,繁殖,培养基（无,35,S-aa,加入乳糖）,-gal(,无,35,S),大肠杆菌对乳糖的反应,培养基：甘油,按照,lac,操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的,-,半乳糖苷酶和,-,半乳糖苷透过酶；,培养基：加入乳糖,少量乳糖,透过酶,进入细胞,-,半乳糖苷酶,异构乳糖,诱导物,诱导,lac,mRNA,的生物合成,大量乳糖进入细胞,多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）,异构乳糖,乙酰基转移酶,半乳糖苷透性酶,-,半乳糖苷酶,操纵位点,调节基因,7.2.2,lac,Operon,的模型及其影响因子,Z,编码,-,半乳糖苷酶：,将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,Y,编码,-,半乳糖苷透过酶：,使外界的,-,半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。,A,编码,-,半乳糖苷乙酰基转移酶：,乙酰辅酶,A,上的乙酰基转到,-,半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,mRNA,阻遏蛋白,I,DNA,Z,Y,A,O,P,pol,没有乳糖存在时,阻遏蛋白的调节,阻遏基因,1.,乳糖操纵子调控模型,mRNA,阻遏蛋白,有乳糖存在时,I,DNA,Z,Y,A,O,P,pol,启动转录,mRNA,乳糖,别构乳糖,-,半乳糖苷酶,（,1,）,mRNA,分子的启动子紧接着,O,区，而位于,I,与,O,之间的启动子区,(P),，不能单独起动合成,-,半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。,2.,乳糖操纵子调控机制,阻遏物,lac I,基因产物及功能,lac,操纵子阻遏物,mRNA,是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有,5-10,个阻遏物分子。当,I,基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个,lac,操纵子在这些突变体中就不可诱导。,RNA,聚合酶结合部位,阻遏物结合部位,（,2,）操纵基因是,DNA,上的一小段序列（仅为,26bp,），是阻遏物的结合位点。,操纵位点的回文序列,（,3,）当阻遏物与操纵基因结合时，,lacmRNA,的转录起始受到抑制。,（,4,）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发,lac,mRNA,的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始,mRNA,的合成。,阻遏蛋白单体的结构,阻遏蛋白单体的三级结构,乳糖,（,5,）诱导物不是乳糖,乳糖代谢,生成,lac,诱导物,Allolctose,异构乳糖,别构乳糖,-,半乳糖苷酶,IPTG,，,异丙基,-D-,硫代半乳糖苷,TMG,，巯甲基半乳糖苷,ONPG,O-,硝基半乳糖苷,在研究诱导作用时，很少使用乳糖,安慰诱导物,(gratuitous inducer),：,如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如,:,-,complementation,lacZM15,基因是缺失了编码,-,半乳糖苷酶中第,11-41,个氨基酸的,lacZ,基因，无酶学活性。对于只编码,N-,端,140,个氨基酸的,lacZ,基因（称为,lacZ,），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复,-,半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。,在,lacZ,编码区上游插入一小段,DNA,片段（如,51,个碱基对的多克隆位点），不影响,-,半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该,DNA,小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无,-,互补能力的,-,半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，,lacZM15,放在,F,质粒上,随宿主传代；,lacZ,放在载体上,作为筛选标记。,XL1-Blue,菌株基因型：,endA1 gyrA96(nalR)thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+lacIq,(,lacZ)M15,hsdR17(rK-mK+),+glucose,-glucose,Time(hr),Units of,b-galactosidase,+lactose,Glucose added,（,6,）葡萄糖对,lac,操纵子的影响,代谢物阻遏效应,实验，在,Lac,Glu,培养基上,E.coli,只利用,G,，只有,G,耗尽时，才会利用,lac,葡萄糖抑制,lac,mRNA,的转录：,可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应，仅去掉阻遏物并不能启动,lac,基因表达,有其它因素参与,分解代谢阻遏,(catabolite repression),只有当以乳糖为唯一碳源时，,-,半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入,cAMP,，,-,半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高，可达到只用乳糖为碳源时的水平。这说明，,cell,内,cAMP,的浓度能影响到,-,半乳糖苷酶的合成速率。,葡萄糖对,lac,操纵子表达的抑制是间接的,ATP,腺甘酸环化酶,cAMP,（环腺甘酸）,大肠杆菌中：无葡萄糖，,cAMP,浓度高；,有葡萄糖，,cAMP,浓度低,cAMP,（环化腺苷一磷酸，,cyclic AMP,）,1965,年，,B.Magasonik,发现在大肠杆菌中也含有,cAMP,，而且菌株内,cAMP,的含量常随细胞的生理状态发生变化，即当细胞处于碳源饥饿条件下，,cAMP,水平显著提高，反之在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，,cAMP,水平明显降低；,腺苷环化酶,腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此,cAMP,调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等其他糖类代谢有关的酶。,葡萄糖的降解是通过,cAMP,与,CAP,结合起作用。,CAP,catabolite activator protein,，,由,crp,编码,CRP,catabolite receptor protein,代谢物激活蛋白（,CAP,）,/,环腺甘酸受体蛋白（,CRP,）,CAP,激活转录,?,（,1,）可能直接和,RNA Pol,相互作用；,（,2,）作用于,DNA,，改变其结构，从而帮助,RNA Pol,结合。,CAP,结合位点,CAP,为二聚体，,45KD,，被,cAMP,激活,结合位点,22bp I -70 -50,II-50 -40,CAP,的结合对,DNA,构型的影响,DNA,弯曲,弯曲点位于,CAP,结合位点二重对称的中心,弯曲使,CAP,能与启动子上的,RNA pol,接触,+,转录,无葡萄糖，,cAMP,浓度高时,促进转录,有葡萄糖，,cAMP,浓度低时,不促进转录,Z,Y,A,O,P,DNA,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,的正调控,当阻遏蛋白封闭转录时，,CAP,对该系统不能发挥作用,如无,CAP,存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。,cAMPCAP,复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。,协调调节,葡萄糖对,lac,操纵子的阻遏作用称,分解代谢阻遏,(catabolic repression),。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖,/,乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,Z,Y,A,O,P,DNA,调控区,CAP,结合位点,启动序列,操纵序列,结构基因,Z,：,-,半乳糖苷酶,Y,：通透酶,A,：乙酰基转移酶,cAMPCAP,复合物,The,lac,Operon:When Glucose Is Present But Not Lactose,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,RNA,Pol.,Repressor,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,I,m,constitutive,Come on,let me through,No way,Jose!,CAP,The,Lac,Operon:When Glucose And Lactose Are Present,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,I,m,constitutive,CAP,Lac,Repressor,Repressor,X,RNA,Pol.,RNA,Pol.,Great,I can,transcribe!,Some transcription occurs,but at a slow rate,This lactose has,bent me,out of shape,The,lac,Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,Im,constitutive,CAP,cAMP,Lac,Repressor,Repressor,X,This lactose has,bent me,out of shape,CAP,cAMP,CAP,cAMP,Bind to me,Polymerase,RNA,Pol.,RNA,Pol.,Yipee!,The,Lac,Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is Present,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,CAP,cAMP,CAP,cAMP,CAP,cAMP,Bind to me,Polymerase,RNA,Pol.,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,I,m,constitutive,Repressor,STOP,Right there,Polymerase,Alright,I,m off to,the races.,Come on,let,me through!,Summary of,lac,operon regulation,Glucose,cAMP,Lactose,Transcription of lac mRNA,High,Low,Present,low rate of expression,High,Low,Absent,essentially none,Low,High,Absent,essentially none,Low,High,Present,high rate of expression,lac,operon,的其它问题,lac operon,的功能是在,正负,两个调控体系的协调作用,(coordinate regulation),下实现的。,阻遏蛋白封闭转录时，,CAP,不发挥作用；如没有,CAP,加强转录，即使阻遏蛋白从,P,上解聚仍无转录活性,CAP,组成型合成，所以,cAMP,CAP,复合物取决于,cAMP,含量,腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此,cAMP,CAP,调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶,降解物敏感型操纵子：只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达,2.A,基因及其生理功能,编码,b-,半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢！,生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒,.,所以,lacA,虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累,3.lac,基因产物数量,，,1,：,0.5,：,0.2,不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节,.,方式有二：,核糖体脱离；,多顺反子的差别性翻译,内切酶作用,:,在,lac mRNA,分子内部，,a,基因比,z,基因更易受内切酶作用,总结,-,乳糖操纵子的作用机制,1,、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含,Z,、,Y,、,A,三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列,O,，一个启动子,P,和一个调节基因,I,。,2,、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，,I,基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列,O,处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。,3,、,CAP,的正调节：在启动子上游有,CAP,结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，,cAMP,浓度升高，与,CAP,结合，使,CAP,发生变构，,CAP,结合于乳糖操纵子启动序列附近的,CAP,结合位点，激活,RNA,聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。,4,、协调调节：乳糖操纵子中的,I,基因编码的阻遏蛋白的负调控与,CAP,的正调控两种机制，互相协调、互相制约。,总结,-,乳糖操纵子的作用机制,7.4,其他操纵子,Galactose OperonArabinose Operon,7.4.1,半乳糖操纵子,大肠杆菌半乳糖操纵子,(galactose operon),包括,3,个结构基因：,异构酶,(UDP-galactose-4epimerase,galE,),，,半乳糖,-,磷酸尿嘧啶核苷转移酶,(galactose transferase,galT,),半乳糖激酶,(galactose kinase,galk,),。,Map of the,E.coli,gal operon and nucleotide sequence of the regulatory region,3,个酶的作用：使半乳糖变成葡萄糖,-1-,磷酸。,galR,与,galE,、,T,、,K,及操纵区,O,等离得很远，而,galR,产物对,galO,的作用与,lacI-lacO,的作用相同。,gal,操纵子的特点：,它有两个启动子，其,mRNA,可从两个不同的起始点开始转录；,它有两个,O,区，一个在,P,区上游,-67-53,，另一个在结构基因,galE,内部。,CAP,catabolite activator protein,，,由,crp,编码,CRP,catabolite receptor protein,代谢物激活蛋白（,CAP,）,/,环腺甘酸受体蛋白（,CRP,）,因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，,gal,操纵子仍可被诱导。,现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（,gal,结构基因高效表达）；,而另一类突变株中,gal,基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的,gal,基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。,分析,gal,操纵子,P-O,区的,DNA,序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅,5bp,的启动子，可以分别起始,mRNA,的合成。每个启动子拥有各自的,RNA,聚合酶结合位点,S1,和,S2,。,从,S1,起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，,RNA,聚合酶与,S1,的结合需要半乳糖、,CAP,和较高浓度的,cAMP,。,从,S2,起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的,cAMP-CAP,能抑制由这个启动子起始的转录。当有,cAMP-CAP,时，转录从,S1,开始，当无,cAMP-CAP,时，转录从,S2,开始。,1.cAMP-CRP,对,gal,启动子的作用,为什么,gal,操纵子需要两个转录起始位点？,半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质,-,尿苷二磷酸半乳糖（,UDP-gal,）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，,UDP-gal,是通过半乳糖差向异构酶的作用由,UDP-,葡萄糖合成的，该酶是,galE,基因的产物。,异构酶,(UDP-galactose-4epimerase,galE,),，,生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有,S1,一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于,cAMP-CRP,，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶。,假如唯一的启动子是,S2,，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于,cAMP-CAP,的启动子（,S1,）对高水平合成进行调节。,在,E.coli,中阿拉伯糖的降解需要,3,个基因：,araB,、,araA,和,araD,，形成一个基因簇，简写为,araBAD,分别编码阿拉伯糖代谢需要的三种酶：,核酮糖激酶（,ribulose kinase,），,阿拉伯糖异构酶,（,arabinose isomerase,）,核酮糖,-5-,磷酸差向异构酶,(ribulose-5-phosphate eimerase),7.4.2,阿拉伯糖操纵子,araBAD,和,araC,基因的转录是以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上，,araBAD,基因簇从启动子,P,BAD,开始向右进行转录，而,araC,基因则是从,P,c,向左转录。,复合启动子区主要有：,1,、,P,BAD,区：,Ara BAD,启动子区,2,、,araC,位点：,C,蛋白,阿拉伯糖复合物与操纵子结合区,3,、,-280,区：是,C,蛋白与操纵子结合区,结构,:,具有正负调节功能的操纵子,与,araB,、,araA,和,araD,这,3,结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基因,C,，由调节基因,C,合成的,AraC,蛋白是一个自我调节蛋白autoregulated protein),，它既是,ara,操纵子的正调节蛋白，又是,ara,操纵子的负调节蛋白。,1.,阿拉伯糖操纵子的调节机制,ara,操纵子的调控有三个特点：,第一，,araC,表达受到,AraC,的自动调控。,第二，,AraC,既可充当阻遏物，也可作为激活剂。,第三，,AraC,与,CAP,结合可充分诱导,ara,操纵子。,AraC,蛋白作为,P,BAD,活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的,两种异构体,来实现的。,Pr,是起阻遏作用,的形式，而,Pi,是起诱导作用,的形式，它通过与,P,BAD,启动子结合进行调节。,在没有阿拉伯糖时，,Pr,形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与,AraC,蛋白结合，使平衡趋向于,Pi,形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与,Pr,的结合，使,Pr,离开它的结合位点，然后，产生大量的,Pi,，并与启动子结合。,因为培养基中含有葡萄糖，所以,cAMP-CAP,没有与操纵区位点相结合，,AraC,蛋白处于,Pr,形式并与,A,位点结合，,RNA,聚合酶很少再与,P,c,结合，,araC,基因虽然仍有转录，但受到抑制，只有少量,AraC,蛋白形成，整个系统几乎处于静止状态。,没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖，因为没有诱导物，尽管有,cAMP-CAP,与操纵区位点相结合，,AraC,蛋白仍以,Pr,形式为主，无法与操纵区,B,位点相结合，无,araBAD mRNA,转录。无葡萄糖，有阿拉伯糖时，大量,araC,基因产物以,Pi,形式存在，并分别与操纵区,B,、,A,位点相结合，在,cAMP-CAP,的共同作用下，,araC,和,araBAD,基因大量表达，操纵子充分激活。,araC,的表达受到自身产物,AraC,的自动调控。当没有阿拉伯糖时，,AraC,起着一个,转录阻遏物的作用。,细胞中,AraC,蛋白质稳态水平的测量表明，阻遏,araC,转录大约需要,40,个,AraC,。因此当,AraC,蛋白水平低时,(,就是说在细胞刚分裂之后,),，,araC,将表达直至存在足够的,AraC,去阻遏它的转录。,2.,阿拉伯糖操纵子的自主调节,阿拉伯糖的作用象,AraC,的一个调控器，可将,AraC,由一个阻遏物转换为一个激活剂。阿拉伯糖与,AraC,结合似乎改变了,AraC,同源二聚体化特性和促进了,AraC-CAP,复合物的形成。在这样的条件下，,AraC,阿拉伯糖的作用象是一个转录激活剂，这正是,CAP-cAMP,诱导,araB,，,araA,，,araD,转录所需要的。,当由于,araBAD,编码的蛋白质的代谢使得阿拉伯糖水平下降时，,AraC,又转换成一个阻遏物，同时,araBAD,转录减少，此时尽管,CAP-cAMP,复合物仍然存在于细胞中。有趣的是，当葡萄糖和阿拉伯糖都很丰富时ara,操纵子被阻遏，这个结果表明,araBAD,诱导与,AraC-,阿拉伯糖和,CAP-cAMP,复合物都有关。,7.3,trp,operon,与负调控阻遏系统,lac,gal,和,ara,操纵子是编码分解代谢途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。,在细菌中还有负责一些物质合成代谢的操纵子，例如色氨酸操纵子（,tryptophan operon,trp,operon,）就是负责色氨酸合成的操纵子。,Trp,operon,生物细胞中的氨基酸合成，也受操纵子的调节。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。由于,trp,体系参与生物合成而不是降解,，它不受葡萄糖或,cAMP-CRP,的调控。,色氨酸的合成主要分,5,步完成，有,7,个基因参与整个合成过程。,trpE,和,trpG,编码邻氨基苯甲酸合酶，,trpD,编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，,trpF,编码异构酶，,trpC,编码吲哚甘油磷酸合酶，,trpA,和,trpB,则分别编码色氨酸合酶的,和,亚基。,一、色氨酸操纵子的结构,催化分枝酸转变为色氨酸的酶,一、色氨酸操纵子的结构,特点,:,(1),trpR,和,trpABCDE,不连锁；,(2),操纵基因在启动子内,(3),有衰减子,(attenuator)/,弱化子,(4),启动子和结构基因不直接相连，二者被前导序列,(Leader),所,隔开,trp,operon,的阻遏系统,Trp R,四聚体,阻遏蛋白,trp,有活性的阻遏物,SNE299,trp O,不转录,2,阻遏蛋白的结合位点,trpO,-21 +1,，反向重复序列,trpP,-40 +18,活性阻遏物与,trpO,的结合与,RNA pol,与启动子的结合发生竞争,3,阻遏系统,主管转录是否启动，,低浓度,Trp,时，,mRNA,起始合成,粗调开关,3,阻遏系统,在,trp mRNA 5,端,trpE,基因的起始密码前有一个长,162bp,的,mRNA,片段，如果其中,123,150,位碱基序列缺失，,trp,基因表达可提高,6-10,倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都一样。当,mRNA,合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有,140,个核苷酸的,RNA,分子，终止,trp,基因转录。,162bp,的片段,-,前导区,123,150,区序列,-,弱化子,终止的转录的调节区域称为弱化子,(,衰减子,),1,）弱化子：,DNA,中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（,123-150,区）。,123150,实验表明弱化作用需要负载,tRNA,Trp,参与，意味着前导序列的某些部分被翻译了。分析前导序列发现，它包括起始密码子,AUG,和终止密码子,UGA,；如果翻译起始于,AUG,，应该产生一个含有,14,个氨基酸的多肽。这个假设的多肽（实际未观察到）称为,前导肽,。,前导序列具有一个非常有意义的特点，在其,第,10,和第,11,位,上有相邻的,两个色氨酸密码子,。,组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有,7,个相邻的组氨酸密码子。,苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有,7,个苯丙氨酸密码子。,这些密码子参与了,trp,及其他操纵子的转录弱化机制。,P,O,E,4,3,2,1,L,DNA,RNA,ATG,TGA,2 trp codons,1,4,3,2,mRNA,前导区,的序列分析,trp,前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中,4,个分别以,1,、,2,、,3,和,4,表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以,1-2,和,3-4,配对，有时只以,2-3,方式互补配对。,RNaseT1,降解实验（此酶不能水解配对的,RNA,）表明，纯化的,trp,前导序列中确有,1-2,和,3-4,的配对方式，由此定位的,3-4,配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。,UUUU,UUUU,调节区,结构基因,trpR,O,P,前导序列,弱化子区域,UUUU,前导,mRNA,1,2,3,4,弱化子结构,第,10,、,11,密码子为,trp,密码子,终止密码子,14aa,前导肽编码区,:,包含序列,1,形成发夹结构能力强弱：,序列,1/2,序列,2/3,序列,3/4,trp,密码子,UUUU,Terminator,研究引起终止的,mRNA,碱基序列,，,发现该区,mRNA,通过自我配对可以形成,茎,-,环,结构，有典型的,终止子,特点。,UUUU,3,4,UUUU 3,3,4,核糖体,前导肽,前导,mRNA,1.,当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,1,2,5,trp,密码子,弱化子结构,就是终止子,可使转录,前导,DNA,UUUU 3,RNA,聚合酶,终止,UUUU,3,4,2,4,2,3,UUUU,核糖体,前导肽,前导,mRNA,1,5,trp,密码子,结构基因,前导,DNA,RNA,聚合酶,2.,当色氨酸浓度低时,Trp,合成酶系相关,结构基因被转录,序列,3,、,4,不能,形成弱化子结构,弱化子对转录调控的关键,空间结构，,10th and 11th codons encode the,trp,residues (rare AA),时间，核糖体停顿在,2,个,Trp,密码子上时，产生延宕,(,delay,),，此时,4,区未转录出来,The leader peptide is to determiner,trp,availability and to regulate transcripti