中药制剂分析第十章植物药用成分的提取.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 概 述,植物的化学成分,共有：普遍存在，没什么生物活性，不起医疗作用，称为“无效成分”。,某些植物特有：有明显生物活性并有医疗作用，通常称为“有效成分”。,但是，有效与无效只是相对的。,一、溶剂提取法,1.,溶剂提取法的原理,溶剂提取法是根据天然植物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。,选择溶剂要注意以下问题：,溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；,溶剂不能与有效成分起化学反应；,溶剂要经济、易得、使用安全等。,（,2,）渗漉法,（,3,）煎煮法,（,4,）回流提取法,（,5,）连续提取法,（,6,）超临界流体萃取,（,7,）酶法提取,水煎煮,（,4,）回流提取法,（,5,）连续提取法,索氏提取器,（,6,）超临界流体萃取,用超临界流体为萃取剂，从液体或固体中萃取出植物天然药用成分，并进行分离的一种技术。,CO2,因其本身无毒、无腐蚀、临界条件适中等特点，成为超临界流体萃取法中最为常用的超临界流体。,（,7,）酶法提取,用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等，破坏植物细胞壁，以有利于有效成分最大限度的溶出。,4.,影响提取效率的因素,（,1,）原料的粒度,（,2,）提取的温度,（,3,）提取的时间,（,4,）料液配比,二、其他提取法,1.,水蒸气蒸馏法,2.,升华法,3.,压榨法,第二节 银杏黄酮,黄酮类化合物,：,以黄酮（,2-,苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物，也即以,C6-C3-C6,为基本碳架的一系列化合物。,黄酮类化合物生理活性多种多样，主要生理活性表现在：,对心血管系统的作用；,抗肝脏毒作用；,抗炎作用；,雌性激素样作用；,抗菌及抗病毒作用；,泻下作用；,解痉作用。,一、结构与性质,银杏中黄酮类化合物含量较高，特别是叶中，根据分析测定，银杏叶提取物浸膏中含有,160,多种成分，主要是黄酮苷及银杏内酯、白果内酯等。其中黄酮类化合物就有,44,种，到目前为止，已从中分离出,20,多个黄酮类化合物。,R,黄酮和黄酮醇是黄酮化合物中的第一类，也是银杏黄酮中的主要表现形式。,芹菜素 木犀草素,山奈素 槲皮素,银杏双黄酮，银杏黄素。黄色结晶。熔点,347,349(,分解,),。盐酸,-,镁粉反应呈橙红色，三氯化铁反应呈绿色，浓硫酸中呈黄色,(,无荧光,),，氢氧化钠中呈黄色。存在于银杏科植物银杏的叶、外种皮中。有扩张血管作用，用于治疗心绞痛。,白果素，黄色针状结晶,245,250,软化,约,278,重新固化,最后在,320,熔化,(,分解,),。存在于银杏科植物银杏的叶、罗汉果植物罗汉松的叶中。,有降低血清胆固醇的作用,能使磷脂和胆固醇的比例趋于正常,用于治疗心绞痛。,白果素,银杏叶,成品,减压回收乙醇真空干燥,洗脱液,树脂（二次再用）,80%,乙醇,洗涤至无色,洗涤后树脂,水洗液（弃去）,上柱，水洗至无色,吸附树脂,8%,树脂吸附,中性滤液,盐酸调,pH,为,7,过滤液,过粗砂柱,上清液,滤渣（弃去）,沉淀,粗滤液,粗滤,活性炭吸附,浸提液,粉碎、沸水浸提,3,次,pH,为,10,左右，每次,3h,1.,水提取法,二、生产工艺,2.,乙醇提取法,3.,丙酮提取法,银杏叶,提取物（总黄酮）,回收溶剂至干,滤液,20%,乙醇溶液，过滤,提取物,回收乙醇，静置，过滤,滤液,95%,乙醇提取,3,次，过滤提取液,三、质量检测,1.,含量测定,（,1,）基本原理,银杏叶提取物中的黄酮主要为槲皮素,(Quercetin),、山奈素,(Kaempferol),、异鼠李素,(Isorhamnetin),与各种糖基形成的苷，而银杏双黄酮和黄酮苷元在银杏提取物中含量极低，均低于千分之一。因此,HPLC,分析测定银杏黄酮类化合物含量时一般通过酸水解方法，使许多复杂的黄酮苷转化为简单的槲皮素、山奈素和异鼠李素三种苷元，然后以槲皮素为标准品或槲皮素,+,山奈素,+,异鼠李素为标准品，用,RI,一,HPLC,法测定这三种苷元的含量。最后通过转化系数求得黄酮类化合物的含量。,（,2,）测定方法,色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇,-0.4%,磷酸溶液（,50:50,）为流动相，检测波长为,360nm,。,对照品样品的制备：分别精密称取五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品，加甲醇制成,1mL,分别含,0.03mg,、,0.03mg,、,0.02mg,的溶液，作为对照溶液。,测定时精密吸取对照品溶液与供试品溶液各,10,L,，注入液相色谱仪，测定，分别计算三种黄酮苷元的含量。,四、药理作用与临床应用,银杏黄酮的药理作用,（,1,）,GBE,有防治高血脂的功效,（,2,）改善脑循环,（,3,）抗脂质过氧化作用,（,4,）其他,2.,银杏黄酮的临床应用,（,1,）治疗心脑血管疾病,（,2,）银杏黄酮苷治疗原发性肾病综合症,（,3,）治疗血管性痴呆,（,4,）眼科应用,第三节 挥发油,一、结构与性质,1.,结构,（,1,）萜类化合物,主要是单萜、倍半萜及其含氧衍生物。其构成挥发油的主要成分。,含氧衍生物有醇、醛、酮、醚、酚、酯等，含量虽少但大多具有优异芳香气，是挥发油中的重要成分。,挥发油,也称为精油，是一类广泛存在于植物中具有生物活性的成分，是用水蒸气蒸馏所得的与水不混溶的挥发性油状成分的总称。,（,2,）非萜类化合物,芳香族化合物,主要为萜源衍生物，如麝香草酚、,-,玉金烯等。有些是苯丙烷类衍生物，多具,C6-C3,骨架，多为苯类化合物或其酯类，如桂皮醛等；也有,C6-C1,骨架，如香荚兰醛等。,麝香草酚 桂皮醛 香荚兰醛,脂肪族化合物 在挥发油中也存在某些小分子脂肪族化合物，有挥发性，广泛存在于水果中，如正葵烷、辛醛、丁酸乙酯、鱼腥草素等。,其他类化合物 在药用植物化学成分中，有些虽然不是以挥发油的形式存在，但经过酶解后，产生了一些具有挥发特性的化合物，往往也被称为挥发油。,2.,性质,（,1,）性状,颜色：大多为无色或微带淡黄色，也有少数具有其它颜色。如：,洋甘菊油,显,蓝色,麝香草油,显,红色,气味：大多数具有香气或其它特异气味。,形态：为透明液体，有的在冷却时其主要成分可能结晶析出。这种析出物习称为“脑”，如薄荷脑、樟脑等。,挥发性：指在常温下可自行挥发而不留任何痕迹，这是挥发油与脂肪油的本质区别。,（,2,）溶解性,脂溶性，难溶于水,易溶,石油醚、乙醚、二硫化碳、油脂等,（,3,）稳定性,挥发油对空气、光、热均具有敏感性，经常与空气接触会逐渐氧化失去原有香味，甚至变质（树脂化），使挥发油密度变大、黏度增大、颜色变深、因此挥发油应装入棕色瓶内低温保存。,二、生产工艺,（一）挥发油的提取,1.,水蒸气蒸馏法,将药用植物切碎后，加水浸泡，然后采用直接蒸馏或水蒸气蒸馏法将挥发油蒸馏出来。,2.CO2,超临界流体萃取法,特点：防止氧化、热解及提高品质；,所得芳香挥发油气味与原料相同。,工艺技术要求高，设备费用投资大。,3.,吸收法,4.,有机溶剂提取法,溶剂,石油醚、二硫化碳、四氯化碳、苯等,方法,回流浸出法、冷浸法等,处理,提取后，减压蒸去有机溶剂后即得浸膏精制,加热乙醇溶解浸膏，放置冷却，滤除杂质，回收醇得净油。,（原理：利用乙醇对植物蜡等脂溶性杂质的溶解度随温度下降而降低的特性）,5.,压榨法,此法适用于新鲜原料，如桔、柑、柠檬果皮含挥发油较多的原料。,捣碎,冷压,静置分层,粗品,优点,保持原有的新鲜香味,缺点,可溶出原料中不挥发性物质。,如：柠檬油常溶出原料中的叶绿素，而使柠檬油呈绿色。,（二）挥发油成分的分离,1.,冷冻处理,将挥发油置于,0,以下使析出结晶，如无结晶析出可将温度降至,-20,，继续放置。取出结晶再经重结晶可得纯品。,例：薄荷油制备薄荷脑,薄荷油,析出粗脑,油,析出粗脑,较纯薄荷油,-10,放置,12,小时,（第一批）,（第二批）,-20,冷冻,24,小时,加热熔融,0,冷冻,2.,分馏法,利用成分沸点不同，气化先后次序不同进行分离的。,沸点规律：,1.,碳原子数：碳多沸点,2.,双键数：多沸点,3.,官能团：极性大沸点,酸,醇,酮,醛,醚,4.,反式的沸点,顺式,例：薄荷醇的提取分离,薄 荷,薄荷油,20150,150200,200230,230300,水蒸气蒸馏,分 馏,单萜烃类,薄荷醇或酮,倍半萜含氧物,薄荷醇和酮,0,以下放置、析脑、过滤,乙醇重结晶,薄荷醇结晶,油,纯薄荷醇,含大量薄荷酮,和少量薄荷醇,200230,3.,化学方法,根据挥发油中各组分的结构或官能团的不同，用化学方法处理，使各组分得到分离的方法。,第四节 强心苷,强心苷,是存在于植物中具有,强心作用,的甾体苷类化合物，由强心苷元和糖缩合而产生的一类苷。,强心苷,是,治疗室率过快心房颤动的首选药和慢性心功能不全,的主要药物。,常见的含强心苷的天然药物,铃兰、紫花洋地黄,R,为鼠李糖,铃兰毒苷,洋地黄毒苷,黄花夹竹桃,黄夹苷甲,黄夹苷乙,羊角拗,R,为,L,夹竹桃糖,羊角拗苷,蟾 蜍,蟾毒灵,一、结构与性质,（一）结构,强心苷,的基本结构是由甾醇母核和连在,C17,位上的不饱和内酯环构成苷元部分，然后通过甾醇母核,C3,位上的羟基和糖缩合而成。,根据苷元部分,C17,上连接的不饱和内酯环的类型分为甲型（蟾蜍甾烯型）和乙型（强心甾烯型）两类。,强心苷,元是由甾体母核与,C,17,取代的不饱和内酯环组成,O,O,H,H,H,O,R,a,O,b,d,r,O,O,H,H,O,a,O,b,d,r,甲,型,海,葱,苷,元,2,0,2,1,2,2,2,3,2,4,3,，,14,-,二羟基海葱甾,4,20,22-,三烯,-,O,O,O,H,H,H,O,R,a,O,O,O,H,H,O,3,5,1,4,b,乙型,型,毛,地,黄,毒,苷,元,H2,0,2,2,2,3,2,1,3,，,14,-,二羟基,-5,-,强心甾,-20,（,22,）,-,烯,（二）性质,1.,通性,强心苷多为无色结晶或无定形粉末，味苦，对粘膜有刺激性。,强心苷的溶解性与所连糖的种类和数目有关，一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂；略溶于乙酸乙酯、含醇三氯甲烷；难溶于乙醚、苯、石油醚等非极性溶剂。,2.,脱水反应,强心苷混合强酸（,3%5%,HCl,）加热水解时，苷元往往发生脱水反应。（,1）,C14-OH,最易发生脱水反应生成缩水苷元。（,2）同时存在,C14-OH和C16-OH,，也易脱水，得到二缩水苷元。,3.水解反应,水解反应是研究强心苷组成的常用方法，分化学方法和生物方法两大类，化学方法主要有酸水解、碱水解和乙酰解；生物方法主要有酶水解。糖部分不同，其水解产物难易及产物均不同。,（,1,）酸水解法,温和酸水解用稀酸（,0.02,0.05,mol/L)的盐酸或硫酸在含水醇中经短时间（半小时至数小时）加热回流，可使,型强心苷水解成苷元和糖。,（,2,）碱水解法,NaHCO,3,、,KHCO,3,主要使,-,脱氧核糖的酰基水解，而,-,羟基糖及苷元上的酰基往往不水解。,Ca,（,OH,）,2,、,Ba,（,OH,）,2,可以使,-,脱氧核糖的、,-,羟基上的、苷元上的酰基水解。,（,3,）乙酰解法,在研究强心苷时，乙酰解常用来研究糖与糖之间的连接位置，如葡萄糖之间的,1,6-,糖苷键很容易乙酰解，而,1,4-,糖苷键较难乙酰解。,（,4,）酶水解法,含强心苷的植物中，,有水解葡萄糖的酶，,在适宜条件下，,能水解糖链末端的葡萄糖,。但无,水解,-,脱氧糖的酶,，所以能水解除去分子中的葡萄糖而保留,-去氧糖。,蜗牛酶,（一种混合酶，蜗牛肠管消化液经处理而得）几乎能水解所有的苷键，能将强心苷分子的糖逐步水解，直至获得苷元，常用来研究强心苷的结构。,二、生产工艺,强心苷提起困难的原因：,强心苷含量很低，,且同一种植物中常含许多结构相近、性质相似的强心苷，每一种苷元又有原生苷和次生苷之分。,多与糖类、皂苷、色素、鞣质等共存，这些成分的存在可影响强心苷在溶剂中的溶解度。,在分离纯化过程中强心苷易受酸、碱或共存酶的作用，发生水解、脱水和异构化等反应，使生理活性降低，故提取分离时应注意控制酸碱性和抑制酶的活性。,一般提取溶剂常用,70%,80%,的甲醇或乙醇，油脂或叶绿素多者要先脱脂；再用铅盐沉淀法或聚酰胺吸附法去除与其共存的杂质；最后再用,CHCl,3,和,CHCl,3,：,MeOH,不同比例混合液依次萃取，将强心苷按极性大小分成几个部分，以备进一步分离。,（二）分离,1.,溶剂萃取法,氯仿,甲醇,水,毛花洋地黄苷,A,毛花洋地黄苷,B,毛花洋地黄苷,C,1:225,1:550,1:2000,均,1:20,几乎不溶,2.,逆流分配法,也是利用强心苷在两相溶剂间分配系数不同而达到分离。,3.,色谱分离法,吸附色谱法一般用于分离亲脂性强心苷（单糖苷或次生苷），常用中性氧化铝（或硅胶）做吸附剂，苯、苯,-,氯仿、氯仿,-,甲醇做洗脱剂。,4.,液滴逆流色谱法,是分离弱亲脂性强心苷的一种有效方法，它是利用混合物中各组分在两液相间的分配系数差别，由流动相形成液滴，通过作为固相的液柱而达到分离纯化的目的。,毛花洋地黄粗粉,粗总苷,加入适量的乙醚,-,丙酮（,2:1,），搅拌成浆状，静置过夜，抽滤，结晶以适量乙醚：丙酮（,1:1,）洗涤，挥散溶剂后，,100,烘干,析出晶体的浓缩液,加入抽松物质量,0.04,倍蒸馏水，再加入少量晶种摇匀，静置,48h,以上，待结晶,浓缩液,加适量甲醇，加热回流至全融。常压回收甲醇至剩余量为抽松量的,0.3,0.4,倍,抽松物,回收氯仿，抽松（糖类等水溶性杂质）,水液,氯仿液,残渣（树脂、色素）,回收氯仿,加乙醇至含醇量,22%,，用水液量,0.3,倍的氯仿提取,2,次,氯仿液,水液,冷后，用,0.4,倍量氯仿提取,1,次,浓缩液,减压回收乙醇至无醇味,胶状物（叶绿素、树脂等）,上清液,加碳酸钠调,pH,至中性，在,60,下减压回收乙醇至含醇量为,10%,20%,，于,15,下静置析胶，过夜，次日吸取上清液,醇液,药渣,用,5,倍量的热乙醇（,60%,70%,）浸渍渗漉，渗漉近完时再加,2,倍量的冷乙醇（,70%,）渗漉,制备实例,粗总苷,结晶（主含苷丙）,母液,减压浓缩，析晶,氯仿层（主要含苷乙）,稀甲醇层,按上述分配比例进行第二次分离,粗结晶（苷丙及部分苷乙）,加压浓缩至小体积，冷却,稀甲醇层,氯仿层（主要含苷甲、苷乙）,先将总苷溶于甲醇，滤过，再向滤液加氯仿和水，按总苷,-,甲醇,-,氯仿,-,水（,1:100:500:500,）的比例进行第一次分离,第五节 香豆素,又称香豆精，为顺式邻羟基桂皮酸的内酯，具特异香气。,香豆素,是具有苯骈,-,吡喃酮母核的一类 化合物的总称，属于苯丙素类衍生物，又称邻羟桂皮酸内酯，具芳香气味。其结构母核为：,1,2,3,7,8,4,6,5苯骈,-,吡喃酮,香豆素类在动植物及微生物中均有分布，如致癌成分,黄曲霉素类,及发光真菌中的,亮菌素类,均属于香豆素类。这类成分分布得最广的还是高等植物中，其中,芸香科,和,伞形科,中分布最多。它们在植物体内以,游离状态,或,与糖结合成苷,的形式存在，苷酶解可环合成游离的内酯状态。,一、结构与性质,（一）结构,1.,羟基香豆素类,绝大部分在苯核上有取代基，几乎所有的,C,7,位都带有含氧基团。,7,8,3,2,4,2.,呋喃香豆素,香豆素核上异戊烯基常与邻位,酚羟基,环合成呋喃环,6,、,7-,呋喃骈香豆素和,7,、,8-,呋喃骈香豆素。,（,1,）线型,（,6,、,7,呋喃骈香豆素型），,补骨脂内酯型,补骨脂内酯,（,2,）角形,（,7,、,8,呋喃骈香豆素型），,白芷内酯型,白芷内酯,(,异补骨内酯,),3.,吡喃香豆素类,香豆素母核上,C6,位或,C8,位的异戊烯基与邻羟基环合而成,2,，,2-,二甲基,-,吡喃环结构的香豆素类。,（,1,）线型（,6,，,7,吡喃骈香豆素）：,（,2,）角型（,7,，,8,吡喃骈香豆素）：,黄曲霉素,4.,其他香豆素：,指,-,吡喃酮环上有取代基的香豆素类。,C3,、,C4,位常有苯基、羟基、异戊烯基等的取代。,黄檀内酯,蟛蜞菊内酯,3,4,4,（二）性质,1.,性状,游离的香豆素,多有完好的结晶形状，熔点,71,，沸点,301.7,，具有新割干草的特有气味。分子量小的有挥发性，能随水蒸汽蒸出，具升华性。而多数香豆素苷无香气，也不能升华。,游离香豆素,-,不溶于冷水，溶于沸水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂。,香豆素苷,-,溶于水、甲醇、乙醇，难溶于氯仿、乙醚。,某些香豆素及其衍生物具有荧光，在碱性溶液中荧光更显著。荧光的有无与强弱，与分子中取代基的种类和取代位置有关，如,7-,羟基香豆素有强烈的蓝色荧光，而,7,，,8-,二羟基香豆素无荧光。,2.,与碱作用,香豆素的,-,吡喃酮环具有,，,-,不饱和内酯性质，在稀碱液中会逐渐水解生成顺邻羟基桂皮酸的盐，而顺邻羟桂皮酸不易游离存在，其盐的水溶液经酸化即闭环恢复成内酯基这个闭合过程极易发生，即使在很弱的酸溶液中，如通入,CO,2,也能促使其内酯化而闭环。,H,Coumaric,H,Coumaric,OH-,H+,O,-,O,O,-,OH,-,H,+,OH,-,长时间加热,+,O,O,-,H,+,OH,-,长时间加热,+,3.,化学反应,（,1,）环合反应,香豆素分子中若酚羟基的邻位有不饱和侧链时，常能相互作用环合成含氧的杂环结构，生成呋喃香豆素或吡喃香豆素类。,OH,O,O,OCH,3,OCH,3,O,HCOOH,O,O,（,2,）加成反应,C3,、,C4,双键、吡喃环或呋喃环上的双键及侧链双键等不同的存在形式。,控制条件下氢化顺序：,侧链不饱和键,吡喃环或呋喃环上的双键,C3,、,C4,双键,3,4,二、生产工艺,由香豆素的理化性质可知游离香豆素大多是,低极性和亲脂性,的，与糖结合的香豆素苷则极性较高，故我们常采用,系统溶剂法,将其分为几个部分。香豆素内酯遇碱皂化、加酸还原的性质及其小分子香豆素 的挥发性和升华性的性质也常用于其分离纯化中。只是由于其性质的不稳定性，在酸、碱、热的作用中要,注意,条件的控制，以免引起结构的破坏，得到次生产物。,1.,香豆素的提取分离方法,（,1,）水蒸气蒸馏法：,小分子的游离香豆素因具有挥发性，可用水蒸气蒸馏法进行提取,。,（,2,）碱溶酸沉法,由于香豆素类可溶于热碱溶液中，加酸又析出，故用,0.5%,氢氧化钠水溶液加热提取，提取液冷却后再用乙醚除去杂质，然后加酸调节,pH,值至中性，适当浓缩，再酸化，则香豆素类及其苷即可析出。,（,3,）系统溶剂法,从中药中提取香豆素类化合物时，可采用系统溶剂法。常用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮和甲醇顺次提取。石油醚对香豆素的溶解度不大，其萃取液浓缩后即可得结晶。乙醚是多数香豆素的良好溶剂，但也能溶出其他能溶性成分，如：叶绿素、蜡质等；其他极性较大的香豆素和香豆素苷，则溶于甲醇或水中。,（,3,）系统溶剂法,石油醚回流提取,石油醚液,回收至小体积,浓缩液,放置、析晶,粗晶,冷石油醚洗,结晶（可能是混和物）,进一步分离,单体,（亲脂性香豆素）,残渣,乙醚液,乙醚回流提取,回收分离,单体,（亲脂性较弱香豆素）,残渣,乙醇提取,香豆素苷类,药材粗粉,回收分离,乙醇液,蛇床子素的提取,蛇床子素的提取,抗心律失常作用,抗菌、抗病毒作用,抗变态反应,蛇床子素对须发藓菌有较强抑制作用，花椒毒酚则具有显著的抗霉菌作用。,蛇床子总香豆素能直接扩张豚鼠器官平滑肌，对豚鼠吸入致痉剂所致的药物性哮喘有明显的保护作用，在体外能拮抗组织胺、慢反应物质引起的肠肌收缩，对小鼠被动性皮肤过敏反应有抑制作用，同时有一定的祛痰作用。,抗炎作用,蛇床子素具有钙拮抗剂的作用。,蛇床子总香豆素对角叉菜胶和鸡蛋清引起的大鼠足趾肿胀均有明显的抑制作用。,生物活性,蛇床子膏的制备工艺流程,蛇床子粗粉用70%,乙醇浸提,3,次，合并提取液，减压回收乙醇，得稠膏。然后加稠膏,3,倍量的氯仿回流提取，过滤，减压回收氯仿，得含蛇床子素的干膏。工艺流程如下：,第十一章 生物技术制药,一、现代生物技术,以现代生命科学为基础,把,生物体系,与,工程学技术,有机结合在一起，按照预先的,设计，定向,地在不同水平上,改造生物遗传性状,或加工生物原料,产生对人类有用的,新产品,(,或达到某种目的,),之综合性科学技术。,二、生物技术制药,生物药物,泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物及生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。,生物技术药物,是将一些难以规模化提取生产的微量生命活动物质，经分离纯化研究确证其结构、功效后，利用,DNA,重组技术和单克隆抗体技术等方法进行规模化生产而获得的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子等药物。包括基因工程药物、酶工程药物、动植物细胞工程药物等。,三、生物技术制药的特点,可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床应用提供有力的保障。,可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理和生化结构进行深入研究，从而扩大这些物质的应用范围。,应用基因工程技术可发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。,内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。,利用基因工程技术可获得新化合物、扩大药物筛选,来源。,四、生物技术药物的种类,1.,细胞因子类,（,1,）干扰素类，,如：,-,干扰素,（,2,）白细胞介素，,已发现,23,种，,IL-1,、,IL-1,IL-23,（,3,）集落刺激因子（,CSF,）类，,如：粒细胞,CSF,（,4,）生长因子类，,如：,EGF,、,HGF,（,5,）趋化因子类,（,6,）肿瘤坏死因子（,TNF,），,如：,TNF-,、,TNF-,2.,激素类,有胰岛素、生长激素、心钠素、人促肾上腺皮质激素等。,3.,治疗心血管及血液疾病的活性蛋白类,（,1,）溶解血栓类，,如：人组织纤溶酶原激活剂（,tPA,）,（,2,）凝血因子类，,如：凝血因子,、,凝血因子,等。,（,3,）生长因子类，,如：促红细胞生成素（,EPO,）、血小板生成素（,TPO,）等。,（,4,）血液制品，,如：血红蛋白、白蛋白等。,5.,可溶性细胞因子受体类，,如：,IL-1,受体、,TNF,受体等。,6.,导向毒素类,（,1,）细胞因子导向毒素，,如：,IL-1,导向毒素、,EGF,导向毒素,（,2,）单克隆抗体导向毒素，,如：抗,-B4-,封闭的蓖麻毒蛋白,7.,基因工程疫苗,（,1,）基因工程亚单位疫苗，,如：乙肝疫苗,（,2,）基因工程载体疫苗，,如：麻疹疫苗,（,3,）核酸疫苗，,如：流感疫苗、单纯疱疹病毒疫苗,第二节 几种重要的生物技术药物简介,一、人生长激素,是脑垂体前叶分泌的一种蛋白质类激素，能促进人和动物的生长，临床上用来治疗多种疾病。,（一）分子结构和性质,由,191,个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，分子质量,21.5kD,，,N,端和,C,末端均为苯丙氨酸。等电点为,5.2,。用糜蛋白酶或胰蛋白酶部分水解,hGH,，其活性并不丧失，说明,hGH,活性不需要整个分子。,H,2,N,COOH,1,191,人生长激素的一级结构,53,165,182,189,phe,（二）生产工艺,1.,合成,hGH,基因,用化学合成法合成,hGH191,肽编码序列，将合成的基因片段用分子克隆技术分别进行克隆化、扩增和纯化，并连接形成完整的,hGH,基因通过定点突变对,hGH,基因进行改造。,2.,构建表达载体,pIN-,-ompA3,质粒含,Ipp,启动子和外膜蛋白,ompA,的信号肽（,1,肽）编码顺序，将经过改造的,hGH,基因克隆到,ompA,信号肽编码序列之后的,EcoR,位点和黏性末端用,DNA,聚合酶的修平的,Hind,位点之间，得到表达质粒,pSS-M,。,3.,细菌转化和表达,hGH,用,pSS-M,质粒转化大肠杆菌,K802,，获得基因工程菌株，能高效表达含信号肽的,hGH,前体蛋白。前体蛋白分泌到细胞内膜时，信号肽被切除，同时形成,2,个二硫键，成熟,hGH,分泌到细胞周质内。,4.,粗提取,通过渗透休克处理，从周质提取,hGH,粗品，纯度约,30%,。,5.,纯化,通过等电点（,pI=5.2,）沉淀，硫酸铵盐析，,Q-Sepharose Fast Flow,阴离子交换柱色谱和,Sephacryl S-200,柱凝胶过滤得,hGH,纯品，纯度达,95%,以上。,（三）检测方法,1.,质量检测,重组,hGH,为澄清透明液体，,SDS-PAGE,测定分子量,21.5KD,，反向,HPLC,分析肽图与标准品一致；等电聚焦电泳测定,pI=5.2,；,N,端氨基酸序列分析结果与文献一致；点杂交法测定残余,DNA,量,100pg,；,HPLC,测定纯度为,95%,。,2.,活性测定,用大白鼠胫骨增宽法测定生物活性为,20IU/mg,蛋白。,3.,生物活性,（,1,）促生长作用,GH,能直接或间接地刺激合成代谢过程，如细胞分裂、骨骼生长和蛋白质合成，因此能促进骨骼肌肉、结缔组织、内脏、皮肤、毛发和全身生长。,（,2,）脂解活性,GH,能增强脂肪的氧化作用。,（,3,）催乳素活性,GH,与催乳素的氨基酸序列约有,50%,的同源性，因此有弱的催乳素活性。,（,4,）升血糖活性,GH,能抑制葡萄糖向全身转移。,（五）临床应用,重组,hGH,主要用于治疗儿童（,15,岁以下）自发性垂体性侏儒症。,还可以用于治疗烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩症、骨质疏松和肥胖症等；,对毛发生长和乳汁分泌有良好效果；,对免疫系统也有一定的增强作用。,