分子生物学常用检测技术名师优质课获奖市赛课一等奖课件.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,分子生物学惯用检测技术,及临床应用,第1页,第2页,DNA,四种核苷酸（,A-T-C-G),组成多聚骨架,全部组成,DNA,核苷酸,dATP,dTTP,dCTP,dGTP,都由三种成份组成：,1,）一个,2,-,脱氧核糖（戊糖）,2,）一个含氮碱基,嘌呤：,AG,嘧啶：,T/C,3,）三个磷酸基团,各单个核苷酸由,5,和,3,-,碳形成磷酸二酯键连接在一起,第3页,变性、复性、退火和淬火,第4页,基因,第5页,分子生物学惯用技术,PCR,（聚合酶链式反应）,核酸分子杂交,基因芯片技术,(biochip),DNA,测序（,DNA sequencing,）,DNA,重组技术,(DNA recombination),第6页,一、聚合酶链反应,（,Polymerase Chain Reaction,，,PCR,）,体外基因扩增技术,特异性强,灵敏度高,操作简单、省时,对待检原始材料质量要求低,高效率基因扩增技术,第7页,（一）,PCR,原理,原理,双链,DNA,变性,退火,链,延伸,（膜板）,（双链分成单链）,（膜板与引物杂交）,（,DNA,合成）,不停重复,第8页,PCR,反应体系,Mg,2+,Mn,2+,dCTP,dGTP,dTTP,dATP,Taq,DNA,聚合 酶,模板,引 物,和,或,和,（二）,PCR,反应设计及影响原因,第9页,PCR,种类,荧光定量,PCR,通用引物,PCR,多重,PCR,巢式,PCR,RT-PCR,原位,PCR,免疫,PCR,第10页,TaqMan,探针,reverse primer,R,Q,forward primer,3,3,5,5,3,5,5,1.Polymerisation,probe,R,Q,3,3,5,5,3,5,5,2.Strand displacement,Q,3,3,5,5,3,5,5,3.Cleavage,R,3,5,5,3,5,5,4.Polymerisation completed,Q,R,R=Reporter,Q=Quencher,3,荧光定量,PCR,第11页,定量,PCR,数学原理,PCR,理 论 方 程,N=N,0,x(1+E),n,N,：,扩增数量,N,0,：,起始模板数量,E,：,扩增效率,N,：,循环数,Log DNA,循环数,线性增加期,Linear,平台期,Plateau,y=,N,0,(1+e),n,指数增加期,Geometric,第12页,定量,PCR,数学原理,Rn(,荧光强度,),循环数,Cycle Number,指数增加期,平台期,C,T,=-k logN,0,+b,Ct,（,Cycle threshold,）值：是指每个反应管内荧光信号抵达设定域值,（,threshold,）,时所经历循环数。,第13页,PCR,临床应用,对病原微生物核酸进行快速检测,填补免疫检测缺点,缩短诊疗窗口期（如,HBV,HIV,）,用于药品疗效监测和评定,用于肿瘤基因表示方面研究,用于遗传病诊疗,第14页,项目,标本采集,HBV,无菌注射器抽取,2,毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。,HCV,EB,1.鼻咽拭子或体液标本。,2.也可取抗凝血标本,但普通不推荐。,CMV,1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。,其它体液标本或咽拭子。,也可取抗凝血标本,但普通不推荐。,TB,1.痰液：患者深部咳痰13ml于无菌加盖试管。,2.其它组织标本：留于无菌试管。,3.也可取抗凝血标本,但普通不推荐。,MP,呼吸道病毒,咽拭子,样本采集要求,第15页,项目,标本采集,所需容器,CT男性：,尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约,2,4,厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜）。,前列腺液、精液。,女性：,阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停,5,秒后旋动棉拭子采取分泌物。,尿道分泌物：同上,一次性无菌带盖试管。,NG,UU,TP,HPV,HSV,第16页,二、核酸分子杂交,依据,核酸变性和复性原理,，不一样起源变性单链核酸分子在适当条件下，经过,碱基互补,形成双链杂交体过程称为,核酸分子杂交,（,molecular hybridization,）。,第17页,1,、遗传病诊疗,2,、病原体判定,3,、癌基因突变检测,4,、组织配型,5,、亲子判定,核酸分子杂交临床应用,第18页,三、基因芯片技术,基质材料分，有,尼龙膜,、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等。,第19页,用点样法固定在玻璃板上,DNA,探针阵列,原位合成法,在玻璃等硬质表面上直接合成,寡核苷酸,探针阵列,第20页,基因芯片技术应用,1,、药品筛选和新药开发,2,、疾病诊疗,3,、环境保护,4,、司法,5,、当代农业,第21页,四、测序技术,CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT,（一）一代测序技术,第22页,（二）二代测序技术,Illumina,企业,Solexa,和,Hiseq,应该说是当前全球使用量最大第二代测序机器，这两个系列技术关键原理是相同。,Illumina/Solexa Genome Analyzer,测序基本原理是边合成边测序。,在,Sanger,等测序方法基础上，经过技术创新，用不一样颜色荧光标识四种不一样,dNTP,，当,DNA,聚合酶合成,互补链,时，每添加一个,dNTP,就会释放出不一样荧光，依据捕捉荧光信号并经过特定计算机软件处理，从而取得待测,DNA,序列信息。,第23页,第24页,技术特点比较,第一代测序技术主要特点是测序读长可达,1000bp,，准确性高达,99.999%,，但其测序成本高，通量低等方面缺点，严重影响了其真正大规模应用。,第二代测序技术大大降低了测序成本同时，还大幅提升了测序速度，而且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。,第25页,五、基因重组技术,基因重组是指一个基因,DNA,序列是由两个或两个以上亲本,DNA,组合起来。,基因重组是遗传基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。,第26页,转基因植物,（抗虫、抗冻、抗病、高产）,转基因动物,基因工程药品和疫苗,基因治疗,基因重组技术应用,第27页,小结,疾病诊疗,感染性疾病诊疗,肿瘤性疾病诊疗,遗传性疾病诊疗,组织配型和器官移植,基因治疗,基因工程产品,转基因植物,转基因动物,基因工程药品和疫苗,法医学方面,分子生物学技术临床应用,用途广泛,功效强大,第28页,基因工程危险性,第29页,基因世界很奇妙，,期待你关注和参加！,第30页,