分子生物学复制.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因信息的传递,地球生命的传奇,生命简史,The Big Bang 150200亿年,Milky Way galaxy 136亿年,solar system 46亿年,The Life Story 40亿年,古细菌、真细菌、真核原生生物,The Life Story 40亿年,寒武纪生命大爆炸 56亿年 多细胞生物,植物登陆 4亿年,动物登陆 3.6亿年,哺乳动物诞生 2.3亿年,灵长类动物诞生 5500万 8000万 年,人类直系祖先诞生 700万 500 万,当代人诞生 510万年,人类文明史 1万年,科学家复原的“杜马伊”形象,学科简史,1859 年 Charles Robert Darwin,1865年 Mendels Pea,1941年 One Gene,One Enzyme,1953年 DNA double helix,1966年 Genetic Code Cracked,1972年 First recombinant DNA,1982年 First transgenic mice,2003年 人类基因组测序基本完毕,分子生物学发展阶段,准备和酝酿阶段,蛋白质是生命的重要基础物质,生物遗传的物质基础是DNA,当代分子生物学的建立和发展阶段,遗传信息传递中心法则的建立,分子生物学发展阶段,初步认识生命本质及改造生命的进一步发展阶段,重组DNA技术的建立和发展,基因组研究的发展,单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展,基因体现调控机理,细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域,第十章 DNA的生物合成,Biosynthesis of DNA,复制过程,起始、延伸、终止,损伤修复,光、切除、重组、SOS修复,复制条件,其它蛋白,酶,聚合酶,引物酶引发体,连接酶,复制特点,半保留复制,半不连续合成冈崎片断,复制DNA,遗传信息 亲代子代；,转录和翻译基因体现,基本的三类RNA,制造蛋白质，决定生物的体现型,中心法则,the central dogma,中心法则的补充,RNA病毒,复制RNA,遗传信息 亲代,子代,逆转录,RNA,DNA,DNA dependent DNA polymerase DDDP,DNA dependent RNA polymerase DDRP,RNA dependent RNA polymerase RDRP,RNA dependent DNA polymerase RDDP,第一节 复制基本规律 复制的特点,一、半保存复制,semiconservative replication,亲代DNA链为模板，合成子代DNA链,子代DNA双链中含一条亲代DNA链,DNA复制机制的三种假说,使子代DNA与亲代DNA不同,1958年 M.Messelson 和 F.Stahl,15,N培养基,14,N培养基,提取DNA，作密度梯度离心,复制基本方式的证明,阐明半保存复制的意义,从原则上确保了遗传的相对保守性,奠定了DNA是遗传物质的地位,二、复制起始点 origin,DNA复制从特定的位点起始（复制子）,富含AT,原核生物 一种,真核生物 多个,三、双向复制bidirectional replication,复制起始点为中心，向两个方向同时进行复制,微生物中，也可进行单向复制,如滚环复制,四、需要引物 primer,DNA P,olymerase,不能从头开始,只能延伸已有核酸链,引物,酶 Primase,合成一小段RNA链(引物),提供3端自由羟基（3-OH）,引物的大小,原核生物:50100个核,苷,酸,真核生物：约为10个核,苷,酸,五、半不持续复制,DNA聚合酶,合成方向 5 3,DNA双链逆向平行,DNA的解链和复制同时进行,5,端,3,端,C,G,A,5,3,ATAT,TTTTT,ATAT,ATAT,TTTTT,领头链(leading strand),持续,随从链(lagging strand),不持续,冈崎片断(Okazaki fragment),原核生物 1K2K,真核生物 100,第二节 酶学和拓扑学变化 DNA复制的条件,底物&模板,解旋解链,DNA聚合酶,DNA连接酶,底物 substrate 模板templatedATP，dGTP，dCTP，dTTP,DNA复制是,模板依赖性,的,(dNMP)n+1+PPi,(dNMP)n+dNTP,DNA,解链及拓扑学变化,解螺旋,酶,（unwinding enzyme）,解链,酶,或 rep蛋白,解开DNA双链,2ATP/bp base pair,解螺旋酶,引发体和RNA引物,引发体:引发前体+引物酶,引发前体:,由若干蛋白因子聚合而成,DnaA蛋白识别复制起始点，并含有ATPase活性。,引物酶,特殊的DDRP,单链DNA结合蛋白,单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB）,又称螺旋反稳蛋白（HDP）,稳定ssDNA，便于复制,保护ssDNA，免受核酸酶的降解,拓扑异构,酶,(topoisomerase),拓扑异构,酶,切断DNA双链中的一条链,松开双螺旋后再将DNA链连接起来,避免出现链的缠绕。,拓扑异构,酶,可切断DNA双链,使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。,解链过程中正超螺旋的形成,DNA,聚合,酶,(DDDP),（一）种类和生理功效：,原核生物,DNA聚合酶（pol）1958年 A.Kornberg,DNA聚合酶（pol）,DNA聚合酶（pol）主力,pol 由十种亚基构成,全酶的核心部分（核心酶）,、和三种亚基构成,亚基 5 3聚合活性,亚基 3 5外切活性,确保DNA复制的精确性/保真性,pol 无 5 3外切活性,外切酶活性的方向,ATTAGCACC,AMP+TTAGCACC,CMP+ATTAGCAC,亚基与模板的结合,亚基形成一种围绕DNA的环状钳,pol 单一肽链,可被某些蛋白酶水解为两个片段,大片段称为Klenow fragment,惯用的工具酶,323个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N 端,C 端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中惯用的工具酶。,原核生物中的三种DNA聚合,酶,真核生物 五种,pol、pol、pol、polpol,pol 含有引物酶活性,pol 主力,Pol 参加线粒体DNA复制,Pol 损伤修复、校读和弥补缺口,pol 低保真参加应急修复,三、复制保真性的酶学根据,碱基配对,酶,学机制：,（一）核酸外切,酶,活性和及时校读,（二）碱基选择,（一）DNA-pol,的核酸外切,酶,活性和及时校读,A：切除错配碱基；,B：配对对的不体现外切活性。,（二）复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子构造协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。,嘌呤的化学构造能形成顺式和反式构型，与对应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处在反式构型。,碱基配对,碱基选择,及时校读,DNA复制的保真性,DNA连接酶,DNA连接酶(DNA ligase),催化DNA片段之间磷酸二酯键形成,DNA连接,酶,催化的条件是：,3-OH，5-P,未封闭的缺口位于双链DNA中（局部）,消耗能量,原核生物中由,NAD,+,供能,真核生物中由,ATP,供能。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶在复制中起接合缺口的作用,在DNA修复、重组及剪接中起同样作用,基因工程的重要工具酶,DNA聚合,酶、DNA连接酶、拓扑酶,都形成磷酸二酯键,区别？,小结,基本特性,origin,semiconservative,semi-discontinuous,Primer,重要酶,Dna Bssb，topo,Primase,DNA Polymerase ,DNA ligase,一、复制的起始,预引发：,DnaA+DnaB+DnaC+SSB,解旋解链，形成复制叉：,组装引发体：,引发,引物,酶,合成引物DnaG,拓扑,酶,解旋,第三节 DNA生物合成过程,oriC构造特性,含三组串连重复序列,富含AT,2对反向重复序列,两个相似次序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成,复制起始识别区,二、复制的延长,（一）聚合子代DNA：,DNA聚合,酶,沿模板链35方向滑动，在53方向聚合子代DNA链,（二）引发体移动：,引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,三、复制的终止,（一）去除引物，弥补缺口：,DNA聚合酶,53 外切酶活性,53 聚合酶活性,（二）连接冈崎片段：,在DNA连接酶的催化下，形成最后一种磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,（三）真核生物端粒的形成：,端粒（telomere）,真核生物染色体末端的构造,普通膨大成粒状,富含G、T的短重复序列构成,末端由于引物RNA的水解而可能缩短,端粒酶,端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR),端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒,酶,(telomerase)的作用机制,第四节 逆转录和其它复制方式自学,逆转录病毒,逆转录酶,cDNA文库,其它复制方式,滚环复制 噬菌体DNA,D环复制 线粒体DNA,第五节 DNA的损伤与修复,DNA损伤突变 mutation,突变的意义,突变的类型,突变的效应,损伤修复,直接修复,取代修复涉及DNA的合成,第五节 DNA的损伤与修复,DNA一级构造的任何变化称为突变 mutation,常见形式,碱基脱落,碱基修饰/去修饰,交联,链的断裂,重组,一、突变的意义,突变是演化的分子基础,横向 自然界生命的多样性,纵向 生命的复杂性,突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,自发因素：,自发脱碱基：,糖苷键的自发断裂，引发碱基脱落,自发脱氨基,C-U,A-H,复制错配,物理因素：,紫外线、电离辐射、X射线,X射线和电离辐射常引发DNA链的断裂,紫外线常引发嘧啶二聚体的形成,TT，TC，CC等二聚体,引发复制障碍。,化学因素,脱氨剂：,亚硝酸与亚硝酸盐,，,可加速C生成U，A生成H,烷基化剂,DNA加合剂,苯并芘,碱基类似物,断链剂,过氧化物，,巯,基化合物,三、DNA突变的类型,点突变,转换 同类型碱基的取代,颠换 不同类型碱基的取代,镰形红细胞贫血,链第6位氨基酸突变,CTC -,CAC,插入 增加一碱基对,缺失 减少一碱基对,碱基的转换,三、DNA突变的类型,复突变,插入 增加一段次序,缺失 减少一段次序,倒位 一段碱基次序发生颠倒,移位 一段碱基次序的位置发生变化,重排 一段碱基次序与另一段碱基次序发生交换,DNA突变的效应,同义突变,有时引发翻译效率下降,误义突变,氨基酸次序变化,无义突变,多肽链提前终止,移码突变(框移突变),四、DNA损伤的修复,DNA损伤的修复方式可分为,直接修复,和,取代修复,两大类。,（一）直接修复：,1光复活：,（light repairing）：,修复嘧啶二聚体的损伤,修复过程,光复活酶（photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物,300600nm可见光获得能量,将嘧啶二聚体的丁酰环打开,光复活酶从DNA上解离。,2转甲基作用,转甲基,酶,去除修饰的甲基,3直接连接,DNA连接,酶,（二）取代修复：,1切除修复(excision repairing)：,广泛存在的修复机制，可合用于多个DNA损伤的修复,核酸内切酶；DNA糖苷酶。,切除修复的过程,DNA,糖苷酶切除碱基形成AP位点,无碱基的片断,核酸内切酶,Pol,DNA连接酶,着色性干皮病(,xeroderma pigmentosis，XP,),切除修复缺点性遗传病,不能修复紫外线照射引发的DNA损伤，易发生皮肤癌。,2重组修复(recombination repairing)：,这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错倾向的修复方式。,重组蛋白RecA、B、C,等催化,3SOS修复：,DNA复制过程中出现,DNA分子受到,长片段高密度损伤,特异性较低的DNA聚合,酶,重组,酶等,小结,DNA复制,特点,origin,条件,primer,方向,过程,真核生物端粒,