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1、原料的定义: •从工艺角度来看,凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料,都可作为发酵工业生产的原料 •具体:一般是含有可发酵性糖或可转化为可发酵性糖的物料,还包括前体物质等等 原料选择的原则 1满足生产工艺要求: 适合微生物需要、吸收利用、代谢产物生产对生产中除发酵以外的其他方面,如通气、搅拌、精制、废弃物的处理等所带来的困难最少2满足管理和经济要求: 原料价格低廉(占成本的比例 •原料资源要丰富,容易收集(60-70‘s,石油烷烃生产谷氨酸 •因地制宜,就地取材 •原料要容易贮藏 3满足环保的要求 资源化减少污染 常用原料种类 •薯类:甘薯、马铃薯、
2、木薯、山药等 •粮谷类:高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等(酒用原料 •野生植物:橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等 •农产品加工副产物:米糠(饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等 •糖蜜 •非粮食生物质原料:纤维素、木质素、半纤维素等 •水果类原料:葡萄、苹果、山楂等 常用原料的化学组成 •碳水化学物:主要是单糖和双糖,发酵微生物的碳源和能源。一些多糖则需转化为单糖或双糖后才被利用 •蛋白质:蛋白质经蛋白酶分解后产生的多肽或氨基酸,是糖化菌和酵母菌生长繁殖的氮源•脂肪:针对不同的发酵产品其作用有较大差别•灰分:主要是P、Mg、K、S、Ca等元素,是微生
3、物生长和代谢所必需 糖蜜:英文名称:molasses 定义:工业制糖过程中,蔗糖结晶后,剩余的不能结晶,但仍含有较多糖的液体残留物。玉米浆:外文名corn steep liquor,是制玉米淀粉的副产物,原料为玉米糁、水、玉米汁。制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡,浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体,叫玉米浆,含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质,含大约40%~50%固体物质。味道微咸,是微生物生长很普遍应用的有机氮源,它还能促进 青霉素等抗生素的生物合成。 培养基设计的基本原则 1培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产 物所需的元素,并能提供生物合成和细胞维持 活力所需要的能
4、量 2营养成分恰当的配比 3渗透压(吸收、传质 4pH值 5氧化还原电位(如:专性厌氧菌 如何进行培养基的设计 (1理论计算法 碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物 +CO2+H2O+热量 通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需 的营养物的最低数量。 (2组成微生物的元素包括C、H、O、N、S、 P、Mg和K(见下表,这些元素都要在方程式 中予以平衡 (3有些微生物无力的合成特定营养物,如氨 基酸、维生素或核苷酸。一旦测出其中一种是 生长因子,就要在培养基中加入适量的纯净的 化合物或含有该物质的混合物。 (4碳源具有生物合成的底物和能源的双重作 用,在
5、需氧条件下,对碳源的需要量可以从菌 体对底物的产率系数(Yx/s推算而得。 发酵培养基的组成成分 水 碳源 氮源 无机盐 维生素 缓冲剂 前体和代谢调节剂 消沫剂 促进剂:不促进微生物的生长、只是有助于调 节产物的形成 抑制剂:加入后会抑制某些代谢途径,使另一 途径活跃,从而获得人们需要的代谢产物 预处理的必要性 1,发酵工厂在进行生产前,必须先将原料中混 杂的杂质除去,保证后续工序生产的正常和顺 利进行 2,为保证后续工序生产的正常和顺利进行,还 需对原料进行适当加工 3,为保证生产环境的清洁,必须采用适当的输 送方式将原料从仓库运送至配料罐或反应器。 预处
6、理的方法(方式 1,原料除杂 •筛选•风选•磁力除铁 2,原料的粉碎 (1粉碎的目的: •增加原料受热面积 •粉末状原料加水混合后容易流动输送 •对于一些带壳的原料,如高粱、大麦,在粉碎 前,则要求先把皮壳破碎 (3粉碎方法 •干粉碎 粗砰常用的设备是轴向滚筒式粗碎机,也有用 锤式粉碎机进行粗碎的例子,常用的细碎设备 是锤式粉碎机 •湿粉碎 湿法粉碎工艺的优点 •彻底消除了粉尘的危害,改善了劳动条件,降 低了原料的损耗 •提高了原料的粉碎细度 •节省了蒸煮时所消耗的蒸气 •粉碎机部件(特别是刀片的磨损减少 •设备简单,对厂房要求不高 (1机械的输送
7、 (2气流输送 优点•设备简单•占地面积小•费用少 •连续化自动化改善了劳动条件 •输送能力和距离有较大的变动范围 •在气流输送的同时,还可对物料进行加热、冷 却、干燥等操作 原理: •气流输送方法,是借助气流的动能,使管道中 的物料被悬浮输送。 气流输送的流程 •吸引式流程(真空输送 •压送式流程(压力输送 流程的比较 •吸引式流程,不需加料器,但要有封闭较好的 排料器; •压送式流程,不需排料器,但要有封闭较好的 加料器; •对相同输送量,压送式流程较吸引式流程采用 较细的管道; •从几个不同的地方,向一个卸料点时,吸引式 流程较适合;从一个加料点向
8、几个不同地方送 料时,压送式流程较适合 淀粉在水-热处理过程的中变化 (1水-热处理的概念•将淀粉质原料与水一起, 在高温高压或低温低压的条件下进行处理的过 程。 (2水-热处理的目的•淀粉原料经过水热处理, 使淀粉从细胞中游离出来,并转化为溶解状态, 以便淀粉酶系统进行糖化作用,这就是原料水- 热处理的主要目的。 淀粉的膨胀和溶解 •膨胀:淀粉是一种亲水胶体,遇水加热后,水 分子渗入淀粉颗粒的内部,使淀粉分子的体积 和重量增加,这种现象称为膨胀。 •糊化:在温水中,当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象,称为淀粉的糊化。此时的温度称为糊化温度。 溶解或液化:
9、淀粉糊化后,如果提高温度至130℃,由于支链淀粉的全部(几乎溶解,网状结构彻底破坏,淀粉溶液的粘度迅速下降,变为流动性较好的醪液,这种现象称为淀粉的溶解或液化。 淀粉的老化 液化后的淀粉醪液在温度降低时,黏度逐步增加,重到重新发生结晶的现象,称为老化 焦糖化:当温度达到糖的熔点时(185℃,糖分脱水形成黑色无定形物,统称焦糖 氨基糖反应:还原糖与氨基酸之间产生的呈色反应称为氨基糖反应。 酶解法液化、糖化淀粉常用的酶 •α-淀粉酶:其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖,对淀粉的作用,可将长链从内部分裂成若干短链的糊精,所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后,遇碘呈色很快反
10、应,如下表现:蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色 •糖化酶:作用于淀粉的l,4键结合,能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断,因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖,所以称为外切淀粉酶。 •β-淀粉酶:β-淀粉酶能水解α-1,4糖苷键,不能水解α- 1,6糖苷键,遇此键水解停止,也不能越过继续水解。β-淀粉酶届于外切酶,水解产物只有麦芽糖。 •异淀粉酶:异淀粉酶能水解支链淀粉和糖原分子中支叉地位的α- 1,6糖苷键,使支叉结构断裂。但对于直链结构中的α- 1,6糖苷键却不能水解。 •普鲁蓝酶能水解支叉结构和直链结构的α- 1, 6糖苷键、支链淀粉、糖原和其β-极限糊
11、精及普鲁蓝分子中的β- 1,6键。 脱支酶——普鲁兰酶vs异淀粉酶 •普鲁兰酶类型的淀粉脱支酶和异淀粉酶类型的淀粉脱支酶都能够专一地切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键,将小单位的支链分解,从而切下整个侧枝,最大限度地利用淀粉原料。•其不同在于:普鲁兰酶作用底物的最小单位是 2个麦芽糖基含1个α-1,6-糖苷键 •异淀粉酶作用底物的最小单位是麦芽三糖基或麦芽四糖基含1个α-1,6-糖苷键,不能水解只有2个葡萄糖基的α-1,6-糖苷键。表现为前者以普鲁兰和支链淀粉为底物,不能作用于植物和动物糖原;后者能够去除支链淀粉和植物、动物糖原中的分支链,却不能作用于普鲁兰。 •异淀粉酶类型的淀
12、粉脱枝酶相较普鲁兰类型 的淀粉脱枝酶具有诸多优点,首先它能同时从 内部和外部水解支链淀粉的分支点;其次它的 催化反应具有不可逆性;再者,异淀粉酶的催 化活性不会被麦芽糖所抑制 DE值:糖化液中还原糖含量(以葡萄糖计占 干物质的百分率,用以表示淀粉糖的糖组成。 还原糖用斐林法或碘量法测定,干物质用阿贝 折光仪测定。 酶法液化方法 •升温液化法-间歇式 工艺:将浓度30~40%淀粉乳调整pH到6.5, 加入CaCl2(0.01mol/L和一定量淀粉酶(5~8u/克 淀粉,剧烈搅拌,加热到85~90℃,保持30~60 分钟,达到液化程度( DE 15~18 ,升温到100
13、℃, 灭酶10 分钟。 此方法简便,但效果较差,能耗大,原料利用 率低,过滤性能差。 •高温液化法(喷淋连续进出料液化法-半连 续式 工艺:将淀粉乳调整到适当pH和Ca2+浓度, 加入一定量的液化酶,用泵打给喷淋头引入液 化罐中(其中已有90℃热水,淀粉糊化后, 立即液化,至保温罐90℃保温40分钟,达到 液化的程度。 优点:设备和操作简单,效果比间歇液化好。 缺点:不安全,蒸汽耗量大,温度无法达到最 佳温度,液化效果差,糖液过滤性能也差 •喷射液化法-连续式 利用喷射器将蒸汽直接喷射至淀粉薄层,以在 短时间内达到要求的温度,完成糊化和液化。 喷射后,进入保温
14、罐,85~90℃保温45分钟。 优点:设备小,便于连续操作,原料利用率高, 转化率高,蛋白质凝聚好。但要求一定压力的 蒸汽,进出料的速度要稳定。 液化程度的控制 •淀粉液化的目的:为糖化酶作用创造条件;合 适的分子大小适合糖化酶作用 •碘试/测定DE值(Dextrose Equivalent •正常DE值10~20(糊精、低聚糖、单糖 –DE值高,糊精太小,不利于糖化酶作用, 影响催化效率,终点DE值低。 –DE值低,液化不彻底,糖化速度慢,酶用 量大,时间长,过滤性能差。 •透光率和澄清度 液化效果的标准 •液化要均匀 • 蛋白絮凝效果好(灭酶,100℃/10
15、min • 液化彻底(60˚C时液化液要稳定,不出现老 化现象,不含不溶性淀粉颗粒,液化液透明、 清亮 糖化理论 •糖化:以无机酸或酶为催化剂,在一定温度下 使淀粉水解,将淀粉全部或部分转化为葡萄糖 等可发酵性糖的过程。 •糖化剂:糖化过程中所用的催化剂。包括无机 酸和酶。 •糖化的目的:将淀粉转化为可发酵性糖。 •理论收率(111.11% •实际收率(105%~108% •淀粉转化率 淀粉水解过程的反应 •主反应:糖化(水解作用 •副反应: –复合反应(在酸和热作用下,部分葡萄糖经1, 6键结合成龙胆二糖,异麦芽糖和其他低聚糖。 –分解反应(葡萄糖分解为
16、羟甲基糠醛,有机 酸和有色物质等非糖产物 糖化的过程检测 •检验液化: 是否有淀粉,用碘液,是否呈兰色; •检验糖化: 是否水解完全 –测定还原糖; –用无水酒精。 (1酸解法(酸糖化法 •定义:以酸(无机酸或有机酸为催化剂,在 高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。 •优点: –工艺简单,设备较单一 –水解时间短,设备周转快 •缺点: –需耐高温、高压和耐腐蚀的设备 –副产物多,淀粉的转化率低–对原料要求高 –废水难处理 (2酶解法 •定义:以酶为催化剂,在常温常压下将淀粉水 解为葡萄糖的方法。包括液化和糖化两个过程, 故又称双酶水解法。 •优点:
17、 –反应条件温和 –副反应少,淀粉质量高 –可在较高淀粉浓度下水解,对预料要求不高 –糖液的质量高、营养物质较丰富 •缺点: –水解时间长,夏天糖液容易变质 –设备较多 糖化方法的比较 •水解时间:酸法短,酶法长 •水解程度:酶法高 •糖液杂质:酶法低,酸法高 酶法糖化的工艺流程 液化→糖化→灭酶→过滤→贮糖计量→发酵•工艺要点: –糖化pH4.2-4.5 –温度60℃左右 –糖化酶用量150U/g淀粉 –糖化时间32小时,用无水酒精检验无糊精存在时,糖化结束,然后将pH调整至4.8-5.0,维持20分钟灭酶 水解糖液的质量要求和控制要点 (1水解糖液的质
18、量要求 •色泽:呈强黄色透明液 •糊精反应:无 •还原糖含量,18%左右 •DE值:90%以上 •透光率:60~80%左右(650纳米 •pH值:4.6~4.8 •淀粉转化率:92%以上(实际产量/理论产量 (2水解糖液的控制要点 •合理控制淀粉乳浓度 •糖液要清 •溶液中不含糊精 •糖液要新鲜 •糖液贮存容器一定要保持清洁,定期清理和清洗,防止酵母菌等浸入 纤维质原料的预处理 •物理方法有:–剪切和研磨–高温液态法–高温分解–微波处理–蒸汽爆破–高能辐射•常用的化学法有:–臭氧法–酸水解法–碱法–氧化脱木素法–有机溶剂法 •常用的物理化学法有:–蒸汽爆裂法–氨纤
19、维爆裂–CO2爆破法–蒸汽爆裂与乙醇抽提结合法–氨冷冻爆破法 生物合成的前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中,能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去,其自身结构并无多大变化,但产量却因前体的加入有较大提高。 •灭菌:用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物,包括营养细胞、细菌芽孢和孢子•消毒:用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。 工业上具体措施包括: 1使用的培养基和设备须经灭菌; 2好氧培养中使用的空气应经除菌处理; 3设备应严密,发酵罐维持正压环境;4培养过程中加入的物料应经过灭菌; 5使用无污染的纯粹种子。 培养基灭菌的目的•杀灭培养基中的微生
20、物,为 后续发酵过程创造无菌的条件。 培养基灭菌的要求 •达到要求的无菌程度(10-3 •尽量减少营养成分的破坏,在灭菌过程中,培 养基组分的破坏,是由两个基本类型的反应引 起的: –培养基中不同营养成分间的相互作用; –对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分 解。 湿热灭菌的原理 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。 当微生物处于最低温度以下时,代谢作用几乎 停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时, 微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的 凝固变性,使微生物在很短时间内死亡,加热 灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。 湿热灭菌中的相关定义 •杀死微
21、生物的极限温度称为致死温度。在致死 温度下,杀死全部微生物所需的时间称为致死 时间;在致死温度以上,温度愈高,致死时间 愈短。 •微生物的热阻:是指微生物在某一特定条件 (主要是温度和加热方式下的致死时间。相 对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间 与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。 湿热灭菌的优点 •蒸汽来源容易,操作费用低,本身无毒; •蒸汽有强的穿透力,灭菌易于彻底; •蒸汽有很大的潜热; •操作方便,易管理。 保证间歇灭菌成功的要素 •内部结构合理(主要是无死角,焊缝及轴封装 置可靠,蛇管无穿孔现象 •压力稳定的蒸汽 •合理的操作方法 连续
22、灭菌的流程 喷射加热-真空冷却流程 板式换热器灭菌流程 连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程 维持罐 灭菌系统中的维持设备,主要是使加热后的培 养基在维持设备中保温一段时间,以达到灭菌 的目的,也称保温设备 喷射加热器 可使料液和蒸汽迅速接触,充分混合,加热是 在瞬时内完成的。 连续灭菌的优缺点 •优点 –保留较多的营养质量 –容易放大 –较易自动控制; –糖受蒸汽的影响较少; –缩短灭菌周期; –在某些情况下,可使发酵罐的腐蚀减少; –发酵罐利用率高; –蒸汽负荷均匀。 •缺点 –设备比较复杂,投资较大。 分批灭菌的优缺点 •优点 –设备投资较少
23、–染菌的危险性较小 –人工操作较方便 –对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 •缺点 –灭菌过程中蒸汽用量变化大,造成锅炉负荷 波动大,一般只限于中小型发酵装置。 发酵罐的灭菌 培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵 罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。在 保温结束后,关键是随即通入无菌空气,使容 器保持正压,防止形成真空而吸入带菌的空气。 不同种类的杂菌对发酵的影响 •青霉素发酵:污染细短产气杆菌比粗大杆菌的 危害大 •链霉素发酵:污染细短杆菌、假单孢杆菌和产 气杆菌比粗大杆菌的危害大 •四环素发酵:污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆 菌的危害较大 •柠檬酸
24、发酵:最怕污染青霉菌 •肌苷、肌苷酸发酵:污染芽孢杆菌的危害最大 •谷氨酸发酵:最怕污染噬菌体 •高温淀粉酶发酵:污染芽孢杆菌和噬菌体的危 害较大 不同染菌时间对发酵的影响 •种子培养期染菌:菌体浓度低、培养基营养丰 富 •发酵前期染菌:杂菌与生产菌争夺营养成分, 干扰生产菌的繁殖和产物的形成 •发酵中期染菌:严重干扰生产菌的繁殖和产物 的生成 •发酵后期染菌:如杂菌量不大,可继续发酵。 如污染严重,可采取措施提前放罐 不同染菌途径对发酵的影响 •种子带菌:种子带菌可使发酵染菌具有延续性 •空气带菌:空气带菌也使发酵染菌具有延续性,导致染菌范围扩大至所有发酵罐
25、 •培养基或设备灭菌不彻底:一般为孤立事件,不具有延续性 •设备渗漏:这种途径造成染菌的危害性较大染菌对产物提取和产品质量的影响 •对过滤的影响: 发酵液的粘度加大 菌体大多自溶 由于发酵不彻底,基质的残留浓度增加 • 造成的后果: 过滤时间拉长,影响设备的周转使用,破坏生产平衡 大幅度降低过滤收率 •对提取的影响 有机溶剂萃取工艺:染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质,易发生乳化,使水相和溶剂相难以分开 离子交换工艺:杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附,大大降低离子交换树脂的交换量 •对产品质量的影响 对内在质量的影响:染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它
26、杂质。对产品的纯度有较大影响。(内毒素、热原 对产品外观的影响:一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液,放置后会出现混浊,影响产品的外观。 目前生产上常用的杂菌检查方法有: ①显微镜检查:染色镜检 ②平板划线检查: 倒平板空培养待测样品划线培养观察 ③酚红肉汤培养检查:无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察 •判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据•无菌试验的目的: 1,监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底 2,监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入 3,了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角 各种检查方法的比较 •显微镜检查方法简便、快速,能及时发现杂菌,但由
27、于镜检取样少,视野的观察面也小,因此不易检出早期杂菌。 •平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜才能判断结果,且操作较繁琐,但它要比显微镜能检出更少的杂菌,而且结果也更为准确从染菌的规模来分析染菌原因 •大批发酵罐染菌:空气系统 •部分发酵罐(或罐组染菌:前期可能是种子带 杂菌,或灭菌不彻底,中后期则可能是中间补 料系统或油管路系统发生问题所造成的 •个别发酵罐连续染菌:设备问题(如阀门的渗 漏或罐体腐蚀磨损,设备的腐蚀磨损所引起的 染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现 象 •个别发酵罐偶然染菌:原因比较复杂,因为各 种染菌途径都可能引起。 从
28、染菌的时间来分析 •发酵早期染菌:种子带菌、培养基和设备灭菌 不彻底、设备或管道有死角 •中、后期染菌:中间补料、设备渗漏、操作不 合理 从染菌的类型来分析 •耐热性芽抱杆菌:死角或灭菌不彻底 •球菌、酵母:可能是从蒸汽的冷凝水或空气中 带来的 •浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌 :发酵罐的冷 却管或夹套渗漏 •霉菌:灭菌不彻底或无菌操作不严格 种子带菌的原因 •无菌室的无菌条件不符合要求 •培养基灭菌不彻底 •操作不当 种子摇瓶培养的注意事项 •保证摇瓶间的清洁卫生 •摇瓶内液体装料不宜过多 •瓶口包扎的纱布一般为八层以上 设备渗漏的原因 • 发酵液中腐蚀
29、性物质对设备的腐蚀 • 磨蚀 发酵液中固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管 摩擦而引起管外壁磨损 冷却介质和加热时蒸汽的冲击,引起管内壁 的磨损 •设备加工不良 弯管时,弯头处管壁变薄 焊接不良 盘管渗漏的防止 •放罐后要认真清洗发酵罐 •控制冷却水质量,降低其中氯离子含量 •对盘管定期检查、试漏,及时发现漏隙 •试漏方法 –气压试验:先在发酵罐内放满清水,用压缩 空气通入管子,观察水面有无气泡产生以确定 管子有否渗漏和渗漏的部位。 –水压试验:用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐 压入冷却管,泵到一定压力时,观察管子有否 渗漏现象 防漏 在发酵罐底的出料阀门和空气
30、管道连接的蒸汽 管道上的阀门,可安装双重阀,其优点是:即 使阀门1有渗漏,蒸汽也可通过阀门3排除 隔膜阀有以下优点: •严密不漏。•无填料。 •阀结构为流线型,流量大,阻力小,无死角, 无堆积物,在关闭时不会使紧密面轧坏。 •检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱落。 膜隔阀的缺点: •制造不够精密;体积较大,在管道上占用较大 的面积和空间。 •中心易引起渗漏。 •隔膜阀开关费力,需要借助扳手。 •橡胶隔膜是橡胶和帘布复合制成,如质量不好, 帘布与橡胶易脱落,固定隔膜的螺栓也易脱落。 管路的连接 •螺纹连接 •法兰连接 •焊接 死角是指灭菌时因某些原因使灭
31、菌温度达不到 或不易达到的局部地区。 染菌后的挽救措施 •种子培养或种子罐中发现污染。 •发酵早期染菌可以适当添加营养物质,重新灭 菌后再接种发酵。 •中后期染菌,如果杂菌的生长将影响发酵的正 常进行或影响产物的提取时,应该提早放罐。• 有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多, 如果提早放罐,这些物质会影响后处理提取使 产品取不出,此时应先设法使碳、氮源消耗, 再放罐提取。 引起噬菌体感染的原因 •设备的渗漏 •空气系统、培养基灭菌不彻底 预防噬菌体感染的措施 •发酵罐的排气管要用汽封或引入药液(如高锰 酸钾、漂白粉或石灰水等溶液槽中。 •取样、洗罐或倒罐的
32、带菌液体要处理后才允许 排入下水道。 •把好种子关,实现严格的无菌操作。 •搞好生产场地的环境卫生。车间四周要经常进 行检查,如发现噬菌体即时用药液喷洒。 感染噬菌体后采用的理方法 • 选育抗性菌株。 • 轮换使用专一性不同的菌株。 • 加化学药物(如谷氨酸发酵可加2~4ppm氯霉素,0.1%三聚磷酸钠,0.6%柠檬酸钠或铵等。• 将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热, 70~80˚C 经5分钟即可杀死。 一般按染菌机率为10-3,即1000 次发酵周期所用的无菌空气只允许1~2次染菌。 辐射灭菌原理 •α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋
33、白质,破坏生物活性物质,从而起到杀菌作用。 •通常用于无菌室和医院手术室。 缺点•杀菌效率较低,杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。 加热灭菌•利用压缩热进行空气灭菌 静电除菌 1,原理•利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。 2,优点•阻力小•染菌率低•除水、除油的效果好•耗电少 3,缺点•设备庞大、一次性投资较大、捕集率尚嫌不够,需要采取其它措施。 过滤介质的类型 •表面过滤介质: –编织网粉末烧结 •深度过滤介质: –纤维材料结构 •棉花 •活性炭或玻璃纤维 •有机合成纤维 –浇铸膜结构 表面过滤介质定义 所有滤孔在一
34、个平面上 依靠直接拦截捕获颗粒 深度过滤介质定义 污染物被介质内部结构捕获的一种过滤介质,滤孔贯穿于整个介质厚度。 调整流道可以获得高容污能力 过滤机理 直接拦截 惯性撞击 扩散拦截 种子扩大培养:是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 作为种子的准则 •菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长,迟缓期短; •生理形状稳定; •菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求;•无杂菌污染; •保持稳定的生产能力。 种子制备的过程大致可分为:
35、–实验室种子制备阶段 –生产车间种子制备阶段 实验室种子的制备一般采用两种方式 –对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖 快的菌种可以采用固体培养基培养孢子,孢子 可直接作为种子罐的种子,这样操作简便,不 易污染杂菌。 –对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种, 可以用液体培养法。 种子罐的作用:•主要是使孢子发芽,生长繁殖 成菌(丝体,接入发酵罐能迅速生长,达到 一定的菌体量,以利于产物的合成。 种子罐级数的确定 •种子罐级数:是指制备种子需逐级扩大培养的 次数,取决于: –菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度; –所采用发酵罐的容积 影响种子质量的因素及控制
36、 •孢子的质量•培养基•培养条件•种龄•接种量 影响孢子质量的因素及控制 •培养基•培养条件•培养时间和冷藏时间 种龄:是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下 一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 接种量:是指移入的种子液体积和接种后培养 液体积的比例。 菌种衰退:菌种经过长期人工培养或保藏,由 于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或 消失的现象 菌种退化的原因: •基因突变; •变异菌株性状分离; •连续传代 •其它因素–菌种保藏不当–生长条件不满足 (培养基组成、培养条件 防止菌种退化的措施 –控制传代次数 –选择合适的培养条件 –选择合适的保藏方法 –
37、菌种稳定性检查 –分离复壮 菌种复壮:使衰退的菌种重新恢复原来的优良 特性。 复壮措施: –对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞 分离纯化 –淘汰衰退的个体 –选择合适的培养基 发酵工业菌种的来源 •发酵工业水平高低的决定因素:菌种、发酵工 业和提纯工艺 •自然界:土壤、空气、水体等 •诱变菌株:化学诱变、高能射线(宇宙射线、 伽马射线、基因工程诱变 •工程菌株(代谢途径改造:经基因工程、代 谢工程或合成生物学方法进行改良 工业发酵对微生物菌种的要求 (1产物(代谢性能 •终产物浓度(titer高:发酵液中浓度高,利 于纯化,如以g/L表示。 •生产
38、效率(productivity高:短时间内产生大 量的发酵产物,如以单位g/L/h进行表征。 (2底物(代谢性能: •原料成本低:能以廉价原料进行发酵(乙醇发 酵和ABE发酵的例子:淀粉→木质纤维素→合 成气 •转化率(yield高:副产物少,提高原料利用 率和分离纯化难度 •全细胞转化发酵:不利用添加前体物质,举例 如谷氨酸→γ-氨基丁酸+CO2 (3菌株其他特征: •菌种一般为单菌,或明确的几种菌组成,能抗 噬菌体和抗杂菌污染。 •遗传性状稳定,菌种不易变异退化,利于长期 使用和工艺的稳定性 •生产菌种不能是病原菌,不产任何毒素 代谢变化是反映发酵过程中菌体
39、的生长,发酵 参数(培养基,培养条件等和产物形成速率 三者间的关系。把它们随时间变化的过程绘制 成图,就成为所说的代谢曲线。 分批发酵的定义 •是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发 酵方式。 •除氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外,不再 加入 任何其它物质。 分批发酵的特点 微生物所处的环境在发酵过程中不断变化,其 物理,化学和生物参数都随时间而变化,是一 个不稳定的过程。 优点 ●操作简单; ●操作引起染菌的概率低。 ●不会产生菌种老化和变异等问题 缺点 ●非生产时间较长、设备利用率低。 （按照菌体生长，碳源利用和产物生成的变化） –第一类型:生长关联
40、型 产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所 必需的代谢） ， 菌体生长与产物形成不分开。 例 如单细胞蛋白和葡萄糖酸的发酵 –第二类型：部分生长关联型 产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物 的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现 两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成 高峰。例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。 –第三类型:非生长关联型 产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用 中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级 代谢是分开的。如抗生素发酵。 分批发酵的分类对实践的指导意义 Ø如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初 级代谢产物） ， 则宜采用有利于细胞生长的培养 条件，延长与产物合
41、成有关的对数生长期； Ø如果产品是非生长关联型 （如次级代谢产物） ， 则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌 体细胞后延长平衡期，以提高产量。 补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵， 是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新 鲜培养基的发酵方式。 •优点 –使发酵系统中维持很低的基质浓度； –和连续发酵比、不需要严格的无菌条件； –不会产生菌种老化和变异等问题。 •缺点 –存在一定的非生产时间； –和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增 加了染菌的危险。 连续发酵 培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有 产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维 持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基
42、质 浓度、恒定的产物浓度、恒定的 pH、恒定菌体 浓度、 恒定的比生长速率） 下生长的发酵方式。 •优点 –能维持低基质浓度； –可以提高设备利用率和单位时间的产量；– 便于自动控制。 •缺点 –菌种发生变异的可能性较大； –要求严格的无菌条件。 连续发酵的类型 •恒化培养–使培养基中限制性基质的浓度保 持恒定 •恒浊培养–使培养基中菌体的浓度保持恒定 Q 发酵=Q 生物+Q 搅拌-Q 蒸发-Q 辐射-Q 显 温度对发酵的影响 •影响各种酶的反应速率和蛋白质性质 •影响生物合成的方向 •影响发酵液的物理性质 •温度影响代谢物比例 最适温度的确定 Ø最适温度是一种相对概念，是指在该温度下 最适于
43、菌的生长或发酵产物的生成（最适生长 与最适生产温度常不一致） 。 Ø最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条 件和菌体生长阶段有关。 Ø最适发酵温度的选择 –在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度 不一定好。 –温度的选择要参考其它发酵条件。 –温度的选择还应考虑培养基成分和浓度 发酵过程中 pH 变化的原因 1. 基质代谢 （1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小 分子的有机酸，使 pH 下降；产能过程中大量 的 CO2，使 pH 下降；糖缺少时，pH 上升，是 补料的标志之一。 （2）氮代谢： NH4 +;氨基酸中的-NH2 被利用 后，pH 降低；尿素被分解成 NH3，pH 上升， NH
44、3 利用后 pH 下降，当碳源不足时氮源当碳 源利用 pH 上升。 （3 ） 生理酸碱性物质利用后 pH 上升或下降如， (NH4 2SO4，生理酸性盐；硝酸钠利用后产生 碱性。 2. 产物形成 代谢产物呈酸性（ABE 发酵，丙酮酸发酵） ；红 霉素、螺旋霉素发酵 pH 上升。 3. 菌体自溶（autolysis） ：释放氨基氮，pH 上 升，大量 DNA 释放，发酵液粘度增加，后续过 滤困难 pH 对发酵过程的影响 (1 pH 影响微生物的生长 (2 pH 影响酶活性，如细胞膜蛋白的构象，对 胞内酶进行间接影响 (3 pH 影响细胞膜电荷状态，改变细胞膜的透 性 (4 pH 影响培养基组分的
45、解离与溶解度 (5 pH 影响代谢方向和代谢强度：如黑曲霉在 pH2~3 产生柠檬酸，在 pH 中性时产生草酸； 谷氨酸棒杆菌在中性或碱性产生谷氨酸，在酸 性条件下产生谷氨酰胺。 (6 pH 对同一种微生物的生长和产物合成可能 具有不同的影响 引起 pH 下降的因素 Ø碳源过量 Ø消泡油添加过量(脂肪代谢 Ø生理酸性物质的存在 引起 pH 上升的因素 Ø氮源过多 Ø生理碱性物质的存在 Ø中间补料，碱性物质添加过多 pH 在发酵过程中的控制 1、调节基础培养基的配方 Ø调节碳氮比（C/N） Ø添加缓冲剂，如 CaCO3 2、补料控制 • 补加碳源 • 氮源 • 直接加酸加碱（最后选择） 临界氧浓
46、度（C 临） ：指不影响菌体呼吸所允许 的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓 度的最低要求。 根据需氧不同，可将初级代谢发酵分为： a. 供氧充足条件下，产量最大；若供氧不足， 合成受强烈抑制；如：谷氨酸，精氨酸，脯氨 酸等 b.供氧充足条件下，可得最高产量；若供氧受 限，产量受影响不明显；如：异亮氨酸，赖氨 酸，苏氨酸等 c.若供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才获得最 大量产物； 若供氧充足， 产物形成反而受抑制； 如：亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸等 发酵过程的溶氧变化 Ø发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不 断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显 下降 Ø发酵中后期，溶氧浓度明显地受工艺控
47、制手 段的影响，如补料的数量、时机和方式等 Ø发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓 度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明 显地上升 溶氧的控制 Ø调节通风与搅拌（具体内容在通风发酵设备 中介绍） Ø限制基础培养基的浓度，使发酵器内的生物 体浓度维持于适当水平；并以补料方式供给 某些营养成分而控制菌体生长率和呼吸率。 CO2 在发酵中的作用 • CO2 是微生物的代谢产物，同时也是某些合 成代谢的基质。 •影响碳水化合物的代谢及微生物呼吸速率 •它是细胞代谢的重要指标，在发酵过程中， CO2 有可能对发酵有促进作用，也有可能有抑 制作用。 一、 CO2 对发酵的影响 Ø大多数微生物适应
48、 CO2 的浓度：0.02~0.04% Ø CO2 对菌体生长具有抑制作用，当排气中 CO2 的浓度高于 4%时， 微生物的糖代谢和呼吸 速率下降。例如，发酵液中 CO2 的浓度达到 1.6×10-1mol，就会严重抑制酵母的生长；当进 气口 CO2 的含量占混合气体的 80%时，酵母活 力与对照相比降低 20%。 Ø CO2 对菌体生长的促进作用，如克氏梭菌。 Ø CO2 对发酵过程的影响 对发酵促进：如牛链球菌发酵生产多糖，最重 要的发酵条件是提供的空气中要含 5%的 CO2 。 对发酵抑制：如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、 抗生素等发酵的抑制 Ø影响发酵液的酸碱平衡 •呼吸商 （RQ） ：
49、发酵过程中 CO2 释放率 （CER） 与摄氧率（OUR）的比值 发酵过程中所遇到的泡沫，其分散相是无菌空 气和代谢气体，连续相是发酵液。 泡沫对发酵的不利影响 Ø降低发酵设备的利用率 Ø增加了菌群的非均一性 Ø增加了染菌的机会 Ø导致产物的损失 Ø消泡剂会给后提取工序带来困难 影响泡沫稳定的因素 Ø通气与搅拌的强度 Ø培养基的配比及原材料组成 Ø培养基的破坏程度 Ø接种量的大小 Ø培养液本身性质的变化 Ø培养基灭菌的方法和操作 Ø染菌 物理消泡法 原理靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促 使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体 加以分离回收。 方法 罐内消沫法： 罐外消沫法： 优点 不需要
50、引进外界物质、节省原材料、减少污染 机会 缺点 不能从根本众消除引起稳定泡沫的因素 选择消泡剂的依据 •在气-液表面具有较大的铺展系数，具有一定 的亲水性 •低浓度时具有消泡活性 •对发酵过程无毒， 对人、 畜无害和不影响酶的 生物合成 •消泡作用迅速，效果高和持久性能好 •能耐高压蒸气灭菌而不变性， 在灭菌温库下对 设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物 •不影响以后的提取过程 •消沫剂的来源多，价格低，添加装置简单 •不干扰分析系统，如溶解氧、pH 测定仪的探 头 •最好还能做到不影响氧的传递 聚醚类：在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油 （GP） 和聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE， 又称泡敌。 GP，亲
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