水中菌落总数测定实训指导书.doc

国家职业教育水环境监测与治理专业教学资源库
《水环境监测》实训指导书
实训项目名称
水中菌落总数测定
学时
4学时
实训班级

课次

实训时间

实训目的
1.掌握检验水中细菌总数的方法
2.掌握培养基配置方法
一． 实验原理
生活饮用水及其水源水等水体受到生活污水、工农业废水或人和动物粪便的污染后，水中的细菌数量可大量增加，其中病原菌也随之增加，引发传染，危害人类健康，因而水中细菌总数和大肠菌数量可反映水体受微生物污染的程度。水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关。故水的细菌学检验对了解水体被污染的程度，在流行病学和提供水质标准中具有重要意义和价值，它是评价水质污染程度的重要指标之一。。
细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数（CFU）。我国生活饮用水卫生标准中规定生活饮用水的细菌总数1mL中不得超过100CFU。
二． 材料与方法
1． 材料
营养琼脂培养基
配方如下：蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、氯化钠 5g、琼脂 10-20g、蒸馏水 1000mL
制作方法：将上述成分充分混合后加热溶解，调整pH为7.4-7.6，分装于玻璃容器中，103.43Kpa（121℃，151b灭菌20min, 放置于冷暗处备用。
2． 方法
水中细菌总数的平板计数测定方法。
3． 仪器
高压蒸汽灭菌锅；9cm培养皿；1mL、5mL移液管；45mL烧杯；250mL三角瓶，放大镜
三． 实验步骤
1． 水样的采集
① 自来水：先将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌，再打开水龙头是水流5min后，以灭过菌的三角瓶接取水样，以待分析。
若水样内含有余氯，则采样瓶在为灭菌前按采500mL水样加3%硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O溶液1mL的量，预先加入采样瓶内，用以采样后中和水样内的余氯，以防止余氯的杀菌作用。
② 江水、河水、湖水、塘水、水库等水源水：可应用采样器，器内的采样瓶应先灭菌。采样时，将采样器置于水体中所置的深度，水即注入采样瓶中。待注满后取出水面，立即送检，一般不应超过4h，否则需放入冰箱中保存，但不能超过24h。
2． 水样的稀释
根据水被污染的程度的不同，按无菌操作做10倍系列稀释。
3． 细菌总数的测定
（1）自来水：
①用灭菌移液管吸取1mL水样，注入灭菌培养皿中。
②分别倾注15mL已融化并冷却到45℃左右的灭菌营养琼脂培养基，并立即在桌面上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
① 另取一空的灭菌培养皿，倾注45℃左右的灭菌营养琼脂培养基15mL，作空白对照。
② 培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24-48h，进行菌落计数。两个平板的菌落数平均值即为1mL水样的细菌总数。

(2)水源水
①稀释水样：取4个灭菌试管，分别加入4.5mL灭菌水。取0.5mL水样注入盛有4.5mL灭菌水的第一试管中，摇匀成10-1稀释液，再从第一试管取0.5mL至下一试管灭菌水中，如此稀释到第三试管，稀释度分别为10-1，10-2，10-3。稀释倍数看水样污染程度而定，以培养后平板的菌落数在30-300个为最合适。若三个稀释度的菌落数都多到或少到无法计数，则需加大或减少稀释倍数。一般中等污染的水样，取10-1，10-2，10-3三个稀释度，污染严重的取10-2，10-3，10-4三个连续稀释度。

②自最后三个稀释度的试管中各取1mL稀释水样加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
③ 各倾注15mL已融化并冷却到45℃左右的灭菌营养琼脂培养基，立即放在桌面上摇匀。
④ 凝固后倒置于37℃培养箱中培养24-48h。
四． 实验报告
（1）菌落数计算原则
记录各平皿的菌落数后，计算相同稀释度的平均菌落数，供下一步计算用。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平皿的一半，而其余的一半菌落分布有很均匀时，则将此一半菌落数乘2以代表平板的全部菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）细菌总数计算方法：按已获得的同稀释度的平均菌落数的不同情况进行计算。
①首先选择平均菌落数在30-300之间，查表进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数，报告该水样的细菌总数（表1例1）。
②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数（表1例2及例3）。
③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1例4）
④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1例5）
⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1例6）
（3）报告水样品中细菌总数。从水质细菌检测结果，分析饮用水、水源水是否符合标准。
表1 稀释度选择及菌落总数报告方式
例次
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度菌落数之比
菌落总数/个·mL-1
报告方式/个·mL-1
10-1
10-2
10-3
1
1365
164
20
—
16.400
16000或1.6×104
2
2760
295
46
1.6
37.750
37750或3.8×104
3
2890
271
60
2.2
27.100
27100或2.7×104
4
无法计数
10650
513
—
513.000
510000或5.1×15
5
27
11
5
—
270
270或2.7×102
6
无法计数
305
12
—
30.500
30500或3.1×104
五． 注意事项
（1） 严格无菌操作，防止污染。
（2） 注意正确培养方法。