第十章DNA复制.ppt

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replication),一、半保留复制是,DNA复制的基本特征,DNA,生物合成时，母链,DNA,解开为两股单链，各自作为模板,(template),按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的,DNA,，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的,DNA,都和亲代,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,半保留复制,的概念,:,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,C,C,A,C,T,G,G,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,T,C,C,A,T,G,A,C,T,C,C,A,T,G,A,C,A,G,G,T,A,C,T,G,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,+,母链,DNA,复制过程中形成的复制叉,子代,DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,:,全保留式 半保留式 混合式,半保留复制的实验依据,N,15,-DNA,的细菌,培养于普通培养液,第一代,继续培养于普通培养液,第二代,梯度离心结果,N,14,-DNA,N,15,-DNA,对照,（二）半保留复制的意义,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DNA,的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性,。,(,一,),原核生物细胞：,有一个固定的复制起始点,(origin),ori,ter,A B C,二、,DNA,复制从起始点向两个方向延伸形成,双向复制,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,(,二,),真核生物：,多起始点，双向复制,复制叉,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,5,半不连续复制产生的原因？,三、,DNA,一股子链复制的方向与解链方向相反导致,半不连续复制,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为,领头链,。,另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为,随从链,。复制中的不连续片段称为,岡崎片段,(,okazaki,fragment),。,领头链连续合成而随从链不连续合成，就是复制的,半不连续性,。,第二节,DNA,复制的酶学和拓扑学变化,一、,DNA,复制的化学反应,，,，,(,dNMP),n,+,dNTP,(dNMP),n+1,+,PPi,参与,DNA,复制的物质,底物,(,substrate,),:,d,ATP,dGTP,dCTP,dTTP,聚合酶,(polymerase):,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，简写 为,DNA-,pol,模板,(template):,解开成单链的,DNA,母链,引物,(primer):,提供,3,-OH,末端使,dNTP,可以依次聚合,其他的酶和蛋白质因子,二、,DNA,聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合,全称：依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(,DNA-dependent DNA polymerase,),简称：,DNA-,pol,活性：,1,、,5,3,的聚合活性,2,、核酸外切酶活性,5,A G C T T C A G G A T,A,3,|,3,T C G A A G T C C T A G C G A C 5,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,?,能切除突变的,DNA,片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,原核生物的,DNA,聚合酶,I,II,III,3 5,核酸外切酶活性,+,+,+,5 3,核酸外切酶活性,+,-,-,聚合速度（,bp,/min,）,1000-1200,2400,1500060000,持续合成能力,3-200,1500,500000,功能,校对，切除引物，修补空隙,修复,复制,，,，,，,，,DNA-,pol,（,109kD,）,一条多肽链，二级结构以,螺旋,为主,功能,：,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-,pol,Arthur,Kornberg,A.,Kornberg,&R.,Kornberg,323,个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶,大片段,/,Klenow,fragment,604 amino acids(,氨基酸,),DNA,聚合酶,5,核酸外切酶,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-,pol,Klenow,片段是实验室合成,DNA,，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,功能,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-,pol,(250kD),真核生物的,DNA,聚合酶,DNA-,pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体,DNA,复制中起催化作用。,DNA-,pol,DNA-,pol,DNA-,pol,DNA-,pol,不同生物体各种,DNA,聚合酶具有共同的特点,1,、以,dNTP,为,原料,2,、合成,DNA,新链具有,模板,依赖性，严格遵循碱基配对规律。,3,、新链的延长只可沿,5,3,方向,进行。催化核苷酸以,3,，,5,磷酸二酯键相互连接,4,、,DNA,新链生成需,引物的,3,OH,末端延伸,DNA,链，而不能从头合成,DNA,链,三、复制中的分子解链伴有,DNA,分子拓扑学变化,DNA,分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把,DNA,解成单链，它才能起模板作用。,解螺旋酶,(,helicase,),利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链。,引物酶,(,primase,),合成一段,RNA,，提供,3-OH,作为复制的引物。,单链,DNA,结合蛋白,(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,。,解螺旋酶,SSB,防止,DNA,缠绕，打结。,10,8,局部解链后,（二）,DNA,拓扑异构酶改变,DNA,超螺旋状态、理顺,DNA,链,解链过程中,DNA,的缠绕、打结,拓扑异构酶作用特点,既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶,切断双链中的一股，并封闭切口，不需要水解,ATP,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,拓扑酶的作用方式：,连接,DNA,链,3,-OH,末端和相邻,DNA,链,5,-P,末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段,相邻的,DNA,链,连接成一条完整的链。,四、,DNA,连接酶连接,DNA,双链中的单链缺口,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,T,4,DNA,连接酶,大肠杆菌,DNA,连接酶,DNA,连接酶在复制中起最后连接缺口的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,基因工程中连接目的基因和载体,功能,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Replication,第 三 节,（一）复制起始：,DNA,解链形成引发体,需要解决两个问题：,1,.,DNA,解开成单链，提供模板。,2.,形成引发体，合成引物，提供,3,-,OH,末端。,一、原核生物的,DNA,生物合成,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1DNA,解链,2.,形成引发体,Dna,A,Dna,B,、,Dna,C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,含有解,螺旋酶、,DnaC,蛋白、引物酶和,DNA,复制起始区域,的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链,RNA,分子。,引物,3,HO,5,引物酶,3.,合成引物,(,二,),复制的延伸,子链延伸方向：,5,3,在,DNA-,pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个,加入，不断形成磷酸二酯键的过程,领头链的合成,领头链的合成,随从链的合成,随从链的合成,随从链模板,DNA,的折叠环绕,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,5,5,5,RNA,酶,OH,P,5,DNA-,pol,dNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA,连接酶,哺乳动物的细胞周期,DNA,合成期,G,1,G,2,S,M,二、真核生物的,DNA,生物合成,细胞能否分裂，决定于进入,S,期及,M,期这两个关键点。,G1S,及,G2M,的调节，与蛋白激酶活性有关。,蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,3.,增殖细胞核抗原,(PCNA),在复制起始和延长中起关键作用。,1.,多起始点，多复制子、复制的时序性,2.,复制的起始需要,DNA-,pol,（引物酶活性）和,pol,（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子,(replication factor,RF),。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代,DNA,随从链,引物,核小体,1,、引物和冈崎片断比原核生物短,2,、核小体的解聚与重新装配,3,、酶催化速率比原核慢，但由于是多复制子复制，总体速度并不慢,（二）真核生物复制的延长发生,DNA,聚合酶,/,转换,（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题,切除引物的两种机制,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,端粒,(telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。,端粒的功能：,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,端粒的结构特点：,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G,、,T,碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶,(telomerase),端粒酶,RNA(human telomerase RNA,hTR,),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT,),组成,端粒酶催化端区,TG,链的合成,5TTTTGGGGTT TTG-OH 3,CAAAACCCCAAAA,端粒酶,G C,G A,3,A A,5,结合、聚合、杂交,5TTTTGGGGTTTT,G,ggg,t t t t g,3,CAA,AACCCCAAAAC,G A,G A,3 5,TTTT,移位,G G,G,g,G,g,G,g,5TTTT,t t t t g,3,CAA,AACCCCAAAAC,G A,G A,3 5,终止,5TTTTGGGGTTTTG,g g g t t t t g g g g t t t t g-OH,3,5TTTTGGGG TTTTG,g g g t t t t g g g g t t t t g-OH 3,3,5TTTTGGGG TTTTG,g g g t t t t g,g g g t t,3 HO-,g g g g t t,DNA,pol,5TTTTGGGG TTTTG,g g g t t t t g,g g g t t,3,AAAACCCC,AAAACCCC AAAA g g g g t t,1.,遵守严格的碱基配对规律；,2.,聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；,3.,复制出错时,DNA-,pol,的及时校读功能。,DNA,复制的保真性：,逆转录和其他复制方式,第四节,逆转录酶,(reverse transcriptase),逆转录,(reverse transcription),RNA,DNA,逆转录,酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,Temin,Baltimore,Peyton,Rous,1966 Nobel prize winner for his discovery of tumour inducing viruses,（,1911,）,1970,Temin,and Baltimore,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975,Rous,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA,模板,逆转录酶,DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,H,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA(,cDNA,),逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了,20,世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制,(rolling circle replication),三、滚环复制和,D,环复制,是某些低等生物的复制形式，如,X,174,和,M13,噬菌体等。,3,-OH,5,-P,5,5,5,3,3,3,3,5,滚环复制,5,5,3,3,5,dNTP,DNA-,pol,D,环复制,(D-loop replication),是线粒体,DNA(mitochondrial DNA,，,mtDNA,),的复制形式。,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage(Mutation)&Repair,第五节,DNA,突变具体指个别,dNMP,残基以至片段,DNA,在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为,DNA,损伤,(DNA damage),。,从分子水平来看，突变就是DNA,分子上碱基的改变。,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）,只有基因型改变的突变形成,DNA,的多态性,（三）,致死性的突变可导致个体、细胞的死亡,（四）突变是某些疾病的发病基础,一、突变在生物界普遍存在,(,一,),物理因素：辐射,UV,嘧啶二聚体,二、多种化学或物理因素可诱发突变,(,二,),化学因素：,化学诱变剂,(,一,),错配,Hbs,：,Glu,Val,镰形红细胞贫血,三、引起突变的分子改变类型有多种,镰形红细胞贫血病人,Hb,(,HbS,),亚基,N,-,val,his,leu,thr,pro,val,glu,C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人,Hb,(HbA,),亚基,N,-,val,his,leu,thr,pro,glu,glu,C,肽链,C,T,C G,A,G,基因,（二）插入、缺失,0,-Thalassemia(,地中海贫血,),0,Thalassemia,Lepore,血红蛋白症,（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病,框移突变,是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致,框移突变,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,四、,DNA,损伤的修复有多种类型,修复,(repairing,),是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,错配修复,(mismatch repair),直接修复,(direct repair),光修复,(light repairing),切除修复,(excision repairing),重组修复,(recombination repairing),SOS,修复,修复的主要类型：,UV,Potolyase,（,光修复酶）,300-600nm,（一）直接修复系统利用酶简单地逆转,DNA,损伤,（二）核苷酸切除修复系统识别,DNA,双螺旋变形,这是细胞内最重要和有效的修复方式。,其过程包括去除损伤的,DNA,，填补空隙和连接。,主要由,DNA-,pol,和连接酶完成。,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA,聚合酶,OH,P,DNA,连接酶,ATP,E.coli,的切除修复机制,核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的,RNA,聚合酶，即参与,转录偶联修复,(transcription-coupled repair),。,转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于正在转录的,DNA,，使该区域的损伤尽快得以修复。,人着色性干皮病：,Xeroderma,pigmentosis,XP,（三）重组修复,(,四,)SOS,修复,SOS,基因,紫外线,激活,Rec,A,Lex,A,阻遏,蛋白,与,DNA,损伤修复有关的酶和蛋白质,基因表达,Lex,A,阻遏,蛋白,操纵序列,DNA,列表比较原核生物与真核生物,DNA,复制的异同,与,DNA,复制有关的主要酶和蛋白因子有哪些，功能如何,DNA,半不连续复制产生的原因,思考题,