微生物的接种分离和纯培养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验内容：,微生物接种，分离和计数,远离酒精灯的状况下，,不得打开桌上的任何器皿,微生物的接种、分离和计数,接种,接种技术是将微生物接到适于生长繁殖的,人工培养基或生物体内的过程。,接种措施：斜面接种、液体接种、半固,体穿刺接种等,接种工具：接种环、接种针、移液管和刮,铲等,接种必须在严格无菌的环境中进行！,接种措施,斜面接种技术：从已长好的菌种斜面上挑取,少许菌种移至另一新鲜斜面,培养基上；,液体接种技术：从菌种斜面上接入到液体培,养基中；,穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取,少许菌体并竖直穿刺到半固,体培养基中；,接种无菌操作环节,1.将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手,的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两,只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出；,2.右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端,及伸入试管中部分均充足灭菌；,接种无菌操作环节,3.右手无名指、小指和手掌边夹住两试,管棉塞，轻轻拔出，试管口过火后移开，,仍靠近并面向火焰；,4.将接种环伸入试管，稍冷后沾取少许,菌体。,5.如下详见不一样接种措施。,斜面接种技术,1.用接种环经无菌操作从菌种斜面挑取少许,菌体；,2.将接种环引入待接种的斜面，自下而上在,斜面上划一直线，再垂直于该直线持续划线；,3.取出接种环，将试管口再次过火后塞上棉,塞，灼烧用过的接种环并放回原处；,4.将棉塞塞紧，将斜面放入培养箱中培养。,试验菌种：大肠杆菌一支,酵母菌一支,斜面接种技术,斜面划线示意图,液体接种技术,1.以无菌操作挑取少许菌体引入待接种的液,体培养基中，在靠近液面处的试管壁上轻,轻摩擦，合适摇动，使之均匀分布在液体,中；,2.塞紧棉塞后，放入恒温培养箱内培养。,试验菌种：大肠、酵母各一支,穿刺接种技术,1.用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺,与半固体培养基中间，刺至管底，再按,原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻,巧、迅速；,2.塞紧棉塞后，放入37恒温培养箱内培,养24小时观测成果。,试验菌种：四联、变形杆菌各一支,纯种培养,自然界中的微生物通过度离，使之在固体,培养基上成为一种菌落，便可获得纯种。,原理是将待分离的样品进行一定的稀释，,使之分散，在固体培养基上形成单个菌落，,再转接到合适的培养基上，我们一般就认为,是纯种。,措施有琼脂平板划线分离、稀释分离、选择性,培养基分离、单细胞挑取、菌丝切割法等。,分离,琼脂平板划线分离法,稀释分离法,试验菌种：大肠、枯草、四联混合菌菌液,琼脂平板划线分离法,1.,将熔化好的,肉汤培养基,，冷却至45左右；,（,触摸不烫手,）。,2.左手持盛培养基的三角瓶，在,火焰附近,，,用右手手掌边夹取棉塞将三角瓶转移到,右手，瓶口过火；,3.左手取一无菌培养皿，在火焰边稍稍打开,皿盖，倒入培养基15,ml,左右，放在桌面上,轻轻摇匀，待凝后即成平板；,琼脂平板划线分离法,4.以无菌操作用接种环沾取待分离的混合,菌液；,5.左手持培养皿底并使其面向火焰，依次轻,轻而迅速的一条条紧接着划线，划线距离,恰当（尽量靠近，但线与线勿碰到），划,过下面后不要回上去反复划；,6.盖上培养皿盖，倒置于37恒温培养箱中,培养24-48小时后观测成果；,琼脂平板划线分离法,每种划一块,试验安排（两人一组）,斜面接种：两人,1,支,液体接种：两组,1,支（大肠）,平板划线分离：每人划两块平板,稀释分离法,1.取无菌生理盐水（NaCl0.85%)试管三支（每,支4.5ml)，编号、；,2.无菌操作取混合菌液一环于中，摇匀；,3.同法自管至，自管至；,4.用1ml无菌吸管，分别从 管中吸,取0.2ml于三个无菌培养皿中，编号；,5.倒入熔化冷却至45左右的肉汤培养基15ml左右，轻轻摇匀，待凝后倒置培养,24-48小时观测成果。,、,菌悬液,0.2ml,0.2ml,0.2ml,一环,稀释分离示意图,一环,一环,I,II,III,每皿约倒入,15ml,肉汤培养基,冷,却至,45,左右,微生物的计数,血球计数法,平板活菌计数法,计繁殖数法只合适于单细胞状态的微生物,或丝状微生物产生的孢子,血球计数法,一、试验原理,血球计数器是一特制的厚载玻片，上面,刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由,于两者之间存在着距离使之形成一定容积的,小室。滴入待测样品后，使样品均匀充斥小,室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成,单位体积的样品中所含的菌数。,血球计数法,二、血球计数器的构造,25*16,计数室体积,=(1,1,0.1)mm,3,=10,-4,cm,3,1,mm,1,mm,盖玻片,0.1,mm,1/400mm,2,血球计数板,血球计数法,三、血球计数法的环节,1、取待测啤酒酵母菌液，摇匀。并做适,当稀释（以每个中格内20左右为宜）。,2、取洁净干燥的血球计数器，盖上盖玻,片，用滴管吸取少许菌液沿盖玻片边缘滴入,一小滴，菌液自行渗透计数室，静止半晌，,使菌液均匀充斥每小室。,血球计数法,示范动作,血球计数法,3、先在低倍镜下找到计数室，注意光线不,能太亮，再转到高倍镜下，取5个中格进行,计数（每个中格取4个小格）。,计数时注意调整焦距，使不一样焦距的菌,体都计入，在线上的菌，数上不数下，数,左不数右。,血球计数法,4、菌液浓度计算,菌液浓度(菌数/mL)=N25104稀释倍数,其中N为每中格内菌数的平均值。,注意：本试验中取20个小格进行计数，公式自行推导，不可照搬！,平板活菌计数法,一、试验原理,微生物在固体培养基上形成的单菌落，,一般认为是由一种细胞繁殖而来，及一种菌,落代表一种细胞。计数时将待测菌样做一,系列稀释，再取一定稀释度一定量的稀释液,接种到平板上，使其均匀分布。经培养后，,生长成单菌落，由菌落数推算出单位体积菌,液的活菌数。,平板活菌计数法环节,每皿约倒入,15ml,沙保培养基,0.5 ml,0.5 ml,0.5 ml,菌悬液,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,10,-6,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,冷,却至,45,左右,平板活菌计数法,待凝后倒置于28,恒温培养48,hr,后计数。,（选择菌落数在,25250,个左右的平板计数）,菌液浓度计算,菌液浓度（菌数/,mL),=,菌落数稀释倍数2,注：只数浓度合适的两个平板取平均值,注意事项,1.过程的无菌操作,2.稀释分离法中熔化后的培养基倒平板前温度控制,3.稀释法中用吸管取试管中液体的次序从稀到浓,4.取样前注意摇匀待测菌液,5.取样时都要无菌操作。注意取菌液时移液管不要,碰到火焰，以免烧死菌体,6.血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与,载玻片间不能有气泡,7.血球计数时显微镜光线不适宜太亮,试验安排（三人一组）,斜面接种：每组三支,液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支）,穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支）,平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液),稀释分离：,I、II、III,各一块平板（混合菌液),血球计数,：写出小格数目，并算出酵母菌液 浓度。,平板菌落计数：10,-4,、10,-5,、10,-6,各两块平板，共六块（酵母）,试验安排（两人一组）,斜面接种：每人一支（四联，大肠），共两支,液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支）,穿刺接种：每组两支（四联、变形各一支），共两支,平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液),稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液),血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液 浓度。,平板菌落计数：10-4、10-5、10-6各两块平板（酵母）,平板菌落计数：10-4、10-5、10-6各两块平板。每个板上菌落数，选用25-250的进行计算（酵母）,成果观测,斜面接种：四联,液体接种：阐明在液体里的生长位置。,穿刺接种：阐明生长状态。菌的运动性（四联、变形）,平板划线分离：与否得到单菌落（混合菌液),稀释分离：与否得到单菌落（混合菌液),血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液浓度。,思索题,1.微生物的纯种分离一般采用那些措施，并阐明个,措施的特点。,2.什么叫微生物的污染？怎样防止？,3.从两种措施计数得出的菌液浓度与否一致？分析,误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺陷及 各自的合用范围。,4.平板活菌计数中，为何选择生长有25250个菌 落的平板？,