阿尔茨海默症动物模型专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/1/13,#,阿尔茨海默病模型大,鼠构建,动,物,模,型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第1页,阿尔茨海默病,（,AlzheimerS,disease,，,AD,）,是一个起病隐匿进行性发展神经系统退行性疾病,。,主要表现为,进行性认知功效障碍、记忆力减退、运动行为失常和人格改变,等；其主要组织病理学特征是神经元胞外出现,淀粉样蛋白（,A,）聚集形成,神经炎性斑,NPs,，亦称老年斑（,SPs,）、胞内,tau,蛋白异常磷酸化形成,神经原纤维缠结,（,NFTs,）、,神经元凋亡或缺失、突触缺失,等,。伴随,我国近年来人口老龄化越来越严峻，,AD,发病率显著提升,，,在阿尔茨海默病相关研究中，建立理想动物模型颇受关注，这有利于促进阿尔茨海默病病因、发病机制、病理过程，以及寻找和筛选预防与治疗药品等研究深入,。,背,景,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第2页,AD,模型大鼠,研究方案,目录,CATALOG,AD,动物模型学习评价,AD,动物模型研究进展,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第3页,AD,动物模型研究进展,01,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第4页,代,许多,动物都能够成为模拟阿尔茨海默病病理学特征模型，包含鼠、猫、犬、兔、山羊、绵羊、北极 熊和非人类灵长类动物等。其中，小鼠和大鼠相对于其它动物价格廉价、繁殖力强、生存率高、易喂养，有利于进行大样本试验研究，而且含有较强快速学习能力，生理过程靠近人类，所以,小鼠,和,大鼠,是当前最广泛用于制备阿尔茨海默病模型动物。,试验动物选择,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第5页,01,自然,衰老动物模型,快速,老化小鼠模型,以衰老为基础,AD,模型,03,APP,转基因模型,PS1,转基因,模型,tau,相关,模型,多重,转基因模型,转基因,AD,模型,02,化学,损伤,物理,损伤,饮食诱导,各种原因诱发,AD,模型,国内外,AD,动物模型研究进展,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第6页,AD,是一个与年纪亲密相关疾病，衰老原因在,AD,发病过程中起着主要作用。以衰老为,AD,发病基础动物模型成为试验研究中不可或缺,部分,自然衰老,AD,模型,自然,衰老动物模型脑内神经元萎缩，胆碱能功效低下，同时表现为感觉、,运动以及学习,记忆力等各种功效减退，这符合,AD,患者临床表现,。,造,模,方法：将,12,月龄小鼠或,35,月龄大鼠，雌性或雄性，喂养在屏障,环境动物,试验室，直至喂养所需年纪。惯用老年动物年纪为小,鼠,1224,月龄，大鼠衰老,早期,2126,月龄，衰老晚期,3032,月龄。,此,模型优点：动物脑内神经递质及形态学改变是自然发生，与,AD,真实病理生理改变更为靠近，不需要人为损伤、干预,。,缺点,：只是模拟了部分与人类正常衰老相关神经改变，缺乏,AD,相关,A,沉积及,NFT,，,并不能全方面模拟,AD,改变。且动物喂养周期和试验周期长、病死率高。,以衰老为基础,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第7页,快速老化小鼠模型,1975,年日本京都大学,Take-da,教授培养出快速老化小鼠（,senescence accelerated mouse/prone,，,SAMP,）,。今后，依据小鼠衰老程度、寿命和病理表现进行选择性繁殖，其中,SAMP8,作为,AD,动物模型被广泛认可。,此,模型优点：,SAMP8,现有自然衰老小鼠特征，又有类似,AD,脑,部病理,改变及学习记忆障碍，已被广泛应用于研究与年纪相关学习记忆障碍机制及相关药品研发,中,缺点,：该模型成本较高，小鼠寿命短，不适适用于长周期试验,。,以衰老为基础,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第8页,01,02,03,A,注射诱导,模型,东莨菪碱诱导模型,侧脑室注射链脲菌素诱导,模型,化学,高脂饮食诱导模型,硫胺素,缺乏诱导模型,饮食,各种原因诱发动物模型,物理,剥夺动物供氧模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第9页,A,注射诱导模型,脑,内,A,代谢产物沉积是,AD,发病机制中最主要一点,。,A,沉积可引发神经元局灶性坏死、神经元缺失和神经胶质细胞增生，最终引发对应胆碱能神经元功效丧失和学习记忆减退损害。,造,模方法,：大多数,是经过注射,A,到试验动物海马区来实现，剂量范围在,510g,之间，体积多为,5L,。方法有单侧海马内注射、双侧海马内注射等，注射后应留针,10 min,，以确保溶液充分弥散,。,此,模型优点：动物脑内神经递质及形态学改变是自然发生，与,AD,真实病理生理改变更为靠近，不需要人为损伤、干预,。,缺点,：只是模拟了部分与人类正常衰老相关神经改变，缺乏,AD,相关,A,沉积及,NFT,，,并不能全方面模拟,AD,改变。且动物喂养周期和试验周期长、病死率高。,化学损伤致,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第10页,东莨菪碱诱导模型,乙酰胆碱,（,acetylcholine,，,ACh是一个主要中枢神经递质，在学习、记忆方面起着非常主要作用。,AD,患者,基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱合成、,Ch AT,活性及对胆碱摄取能力都显著下降。这些改变程度与患者认知功效损害程度呈正相关,。,造,模方法：东莨菪碱,为,M,胆碱受体,阻断剂，,3mgkg-1,东莨菪碱腹腔,注射,60d,，可阻断小鼠大脑皮层中乙酰胆碱受体结合位点，小鼠出现胆碱能神经系统,障碍一系列,行为学改变，如记忆力下降、认知障碍等。,此,模型优点：简便易行、不需手术、费用较低，是应用广泛,AD,模型建立方法之一，主要用于考查胆碱能系统与,AD,关系及相关药品临床前,评价。,缺点：只模拟了胆碱能功效减退特征，缺乏,AD,经典病理特征，如神经元变性、,A,沉积,等。,化学损伤致,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第11页,侧脑室注射链脲菌素诱导模型,链,脲菌素（,streptozotocin,，,STZ,）是一个烷基化物，腹腔注射可经过破坏胰腺,细胞引发糖尿病。,1998,年,Lannert,和他同事首次建立侧脑室注射,STZ,动物模型，动物出现类似,AD,记忆障碍,。,方法,：将大鼠固定于脑立体定位仪上，在前卤后,1.5 mm,，矢状缝侧方,1.5 mm,处钻孔，微量进样器注射,STZ 3 mgkg-1,，于手术第,1,天和第,3,天分别二次向侧脑室注射。小剂量,STZ,侧脑室注射能够制备痴呆模型。,此,模型优点：模拟了散发性老年痴呆病许多主要特点,。,缺点,：造模过程中动物死亡率较高。,化学损伤致,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第12页,冈田酸诱导损伤模型,tau,蛋白过分磷酸化是引发,AD,病理改变主要机制。调整,tau,去磷酸化蛋白磷酸酶主要有蛋白,磷酸酶,-,2A,（,PP2A,）、,PP2B,、,PP2C,和,PP1,冈,田酸（,OA,）是一个海洋生物提取物，对,PP2A,和,PP1,有 选 择 性 抑 制 作 用,。,方法,：大鼠侧脑室,注射,OA0.4mmolL1,，,1.5,L,，可引发神经细胞变性、坏死，同时促进脑内异常磷酸,化,tau,蛋白,形成，还能造成,A,聚积，产生类似,AD,样病理,特征。,兴奋性毒素损伤模型,在,AD,患者,中，兴奋性毒素过分刺激谷氨酸受体造成神经元死亡。,造,模方法：将溶于,人工脑脊液,IBO,注入大鼠,Meynert,基底核,（,nucleus basalis of meynert,，,NBM,），每只,10 g,，经过损毁大鼠单,侧,NBM,来建立,AD,模型,，动物表现出显著学习记忆障碍。,秋水仙碱诱导模型,以化学为,基础,AD,模型,秋,水仙碱可选择性破坏海马神经元，破坏胆碱能,神经通路，使动物,出现短期学习记忆障碍,。,方法,：侧脑室注射秋水仙碱（大鼠,15g,、小鼠,2.8g,可造成动物在,2,周后,出现显著学习记忆障碍。,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第13页,重金属诱导模型,AD,脑组织内铝含量显著高于正常人，高浓度铝对神经系统有毒害作用，促进大脑内,NFT,和,A,聚集，使神经元变性或死亡，表现为大脑皮质萎缩，出现记忆，认知功效,障碍。,方法,：利用这一机制，小鼠侧脑室注射,0.5%Al Cl3 2 L,，天天,1,次，连续,5 d,，末次注射,15 d,后，小鼠表现出显著空间学习障碍。另外小鼠连续腹腔注射,Al Cl3 100 mgkg-1,，周期,50 d,，隔日,1,次，也可造成记忆损伤模型。,叠氮钠诱导模型,有,研究表明，,AD,患者线粒体功效存在显著异常。叠氮钠（,Na N3,）经过抑制线粒体呼吸链，产生自由基，抑制能量代谢，造成线粒体,损伤,，,导,致 一 系 列 类 似,AD,病 理 改 变。,方法：大,鼠皮下长久给予,Na,N33mgkg,-1,，,2h,皮,下间断注射，天天,8,次,，连续注射,4,周,，,可诱导,A,沉积，出现,类似,AD,认知障碍,。,谷氨酸损伤模型,以化学为,基础,AD,模型,过量谷氨酸可产生严重神经兴奋毒性，造成神经元损伤或死亡，与,AD,发生、发展有亲密关系。,方法：利用新生乳鼠血脑屏障功效不全，外周注射谷氨酸,25mgkg-1,，,40d,后小鼠肥胖，基底前脑多处神经元变性，脑内,APP,免疫阳性改变细胞间隙,A,大量沉积。,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第14页,慢性,缺氧动物模型,AD,模型研究发觉,AD,患者处于长久慢性缺氧状态。经过剥夺啮齿类动物供氧，可诱导与老化脑功效相同能量代谢障碍。,方法,：研究提醒动物经由双侧颈总动脉结扎致全,脑缺血,12,min,，后复,灌,24,h,，会引发行为学上障碍，而且脑组织出现,与,AD,患者,相同病理特征。,该,模型缺点：能够,模拟,AD,临床症状，但,缺乏,AD,特异性,胆碱神经损伤,以及,A,沉积。且因为创伤较大，不相关干扰原因过多，易引发脑内其它部位损伤及造模动物死亡。所以，该模型成功率低，现在已极少使用。,物理损伤致,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第15页,高脂饮食诱导模型,有,报道指出动物给予高脂饲料喂养可降低大脑对葡萄糖摄取，诱导动物模型产生糖耐量降低及胰岛素抵抗，亦可损伤神经元胰岛素受体功效，引发,tau,蛋白过分磷酸化，从而造成,NFT,。,方法,：大鼠给予高脂饮食,2,个月后，即出现胰岛素抵抗，表现出显著空间学习记忆障碍,。,该,模型能够模拟,AD,一些病理特征，比如认知障碍及,tau,蛋白过分磷酸化，主要缺点是造模时间较长,。,饮食诱导,AD,模型,硫胺素,缺乏（,thiamine deficiency,，,TD,）诱导能量代谢下降、糖代谢异常、氧化应激损伤、胶质细胞激活、选择性神经元丢失以及认知功效损害，与,AD,病理生理过程极为相同。,方法,：,8,周,龄,C57,小,鼠，经过给予硫胺素剥夺饮食结合腹腔注射硫胺素焦磷酸激酶抑制剂,吡啶硫胺制作硫胺素缺乏模型，造,模,13d,后,取脑，模型组小鼠内侧丘脑出现经典对称性针尖样出血，小鼠皮质、海马及丘脑均,出现,A,沉积，,tau,蛋白,磷酸化。,TD,可引发,A,沉积、,tau,蛋白,磷酸化增加等,AD,特征性病理改变。,硫胺素缺乏诱导模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第16页,转基因模型是研究,AD,发病机制及相关药品研发较理想工具，同时也成为了近年研究热点。,APP,转基因模型,APP,正常,情况下代谢多经过,-,分泌,酶,和,-,分泌,酶。基因突变时，激活了,-,分泌,酶和,-,分泌,酶，,造成,A,增多，尤其,是,A42,。,A,聚集可形成含有神经毒性原纤维，进而,形成,SP,，,加重,AD,发展,。,方法,：将,突变,APP,基因,（,Val717-Phe,）,与血小板衍生因子,（,platelet derived growth factor,，,PDGF,）,相结合形成,PDAPP,基因,，导入到小鼠体内，,取得,PDAPP,小,鼠。,转基因,AD,模型,位于,12,号染色体上早老素,1(PS1),基因，及,位于,1,号,染色体上早老,素,2(PS2),基因发生突变与家族,性,AD,发病,有着亲密关系。,PS1M146V,小鼠是比较经典,转,PS1,基因,动物。,Catado,等利用,血小板源性生长因子,2,开启子,促进神经元表示，构建了几个过分表示突变型,PS1,转基因鼠，发觉可造成选择性增加,A42,。,PS1,转基因模型,优点,：,APP,转基因小鼠,及,APP/PS-1,双,转基因小鼠是当前国际最为认可,AD,动物,模型，其病理改变出现较早且显著，模拟了,AD,患者脑内,A,增多、,SP,形成,。,缺点,：模型小鼠脑内产生,A,与,AD,患者脑内,A,存在生化组成差异，而且这些小鼠脑内没有发,tau,蛋白磷酸化及,NFT,，也没有表现出,AD,患者特有海马及皮层神经元丢失。这也是多数转基因小鼠模型,缺点。,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第17页,转基因模型是研究,AD,发病机制及相关药品研发较理想工具，同时也成为了近年研究热点。,神经元纤维缠结、,tau,相关模型,AD,患者大脑皮质及海马区,出现,NFT,主要原因,是,tau,蛋白,过分磷酸化。所以认为,tau,基因突变将直接影响,tau,蛋白,结构和功效，引发神经系统疾病，可能是诱发,AD,原因,之一,。,JNPL3,小鼠是将,人类,FTDP-17,突,变,tau,基因导,入,B6D2,（,F1,）,小鼠，然后将其下一代小鼠与,C57BL/6,回交而取得。,转基因,AD,模型,AD,发病过程复杂，与脑内各种基因调控失调有着亲密联络，各种转基因组合方法能够非常成功模拟,AD,病理改变和行为学改变特征，是较为理想,AD,动物模型。,双转基因小鼠,Tg2576/tau P301L,小鼠是由,Tg2576,小鼠和,tau P301L,（,JNPL3,）小鼠杂交而来，其行为学发病方式及出现时间和,JNPL3,相同，,A,沉积同,Tg2576,小与表示人基因组,MAPT,基因小鼠杂交取得。此模型已经成为研究,NFT,病理特征及相关,tau,蛋白生化有力,工具。,多重转基因模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第18页,转基因果蝇模型,研究,表明，在已知人类疾病致病基因中，果蝇含有,约,75%,同源基因，,包含,AD,所,包括,Appl,，,Pen-2,，,Nicastrin,，,tau,以及,GSK-3,等基因,。,除了,含有大量同源基因外，果蝇神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相同表型，如迟发性、进程性和神经系统高毒性,。所以,，果蝇为研究,AD,发病机制以及进行治疗药品筛选和验证提供了另一个模式生物方法,。,惯用,转基因果蝇模型主要,有,APP,转基因,模型、,BACE,转基因模型、,A,转基因模型、,tau,蛋白,转基因模型、双重或多重转基因模型等,。,优点,：果蝇因其基因背景清楚、生命周期短暂、与年纪相关神经元退化显著、繁殖快速以及易于培养观察等特点在,AD,模型中含有独特优势,。另首先,，能够用果蝇模型直接对已经有大量药品进行筛选，以期取得改进疾病症状药品，加紧哺乳动物乃至人类药品试验,。,缺点：是,其肠胃酸碱度以及吸收食物路径与哺乳动物差异较大。,转基因,AD,模型,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第19页,AD,动物模型学习评价,02,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第20页,年,度,工,作,概,述,年,度,工,作,概,述,年,度,工,作,概,述,年,度,工,作,概,述,年,度,工,作,概,述,学习评价,上,述,AD,动物模型各有其优缺点，多数仅能部分模拟,AD,病理学特征及临床症状，尚无一个公认最理想模型。即使是当前最为广泛使用并认可多重转基因动物，也有待于深入完善,。,理想,AD,动物模型应具备以下,3,个方面特征,：,含有,AD,主要神经病理学特征,SP,和,NFT,；,出现,大脑神经元死亡、突触丢失和反应性胶质,细胞增生,等,AD,主要病理改变,；,出现,认知和记忆能障碍,。,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第21页,AD,模型大鼠研究方案,03,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第22页,增殖细胞标识,动物处理,检测指标,研究目标、研究内容,动物模型,制备,、,分组,给药,干预办法,01,02,03,06,05,04,AD,模型大鼠研究方案,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第23页,1,2,明确毛冬青甲素影响阿尔茨海默大鼠脑海马组织神经元再生作用,。,从,BDNF,表示水平影响揭示毛冬青甲素促进神经元再生作用机制，为中医药防治阿尔茨海默病提供试验依据和作用靶点,。,研究,目标,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第24页,1,2,检测毛冬青甲素对阿尔茨海默模型大鼠海马神经元再生影响，经过,A,海马注射大鼠模型，采取尼式染色法观察、,Brdu,标识增殖细胞，用,Image Pro Plus 6.0,图像处理系统进行细胞计数,。,研究,内容,检测毛冬青甲素对阿尔茨海默模型大鼠海马神经元,BDNF,水平影响，采取免疫组化法检测海马组织中,BDNF,表示，采取分子探针检测,BDNF mRNA,表示情况。,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第25页,药品,毛冬青甲素 购于广东省博罗先锋药业集团有限企业,试验动物,SD,大鼠,36,只，清洁级，,180-220g,，雌雄各半,。湖南中医药大学,SPF,级动物试验中心提供,动物,模型制备及分组给药,大,鼠适应性喂养一周后，参考相关文件选择,A,海马注射大鼠模型，将,SD,大鼠用,10%,水合氯醛按,4 m Lkg-1,剂量行腹膜麻醉后，固定于脑立体定位仪上，备皮，消毒，沿颅顶中线做,1-2cm,切口，分离骨膜，找到前囱位置，参考,大鼠脑立体定位图谱,，确定前囟后,3.0 mm,，中线旁,2.0 mm,为海马,CA1,所在部位体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，微量注射器固定于立体定位仪上，自脑表面垂直进针约,2.8mm,，假手术组脑内注射等体积生理盐水；其余各组两侧海马各迟缓均匀注入,1lA25-35,，,5 min,注射完成，留针,5min,，然后迟缓撤针，缝合皮肤并涂红霉素软膏，肌注青霉素，预防感染。清醒后放回笼中常规喂养。,动物造模,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第26页,模型评价,在造模第,20,天，对全部大鼠称重，并进行蔗糖水消耗试验和,Morrsi,水迷宫试验,，,最终,依据试验结果评定大鼠是否造模成功。,动物分组,对造模成功大鼠随机分成,3,组，每组,12,只，分别为假手术组、模型组、毛冬青甲素组。,动物,模型制备及分组给药,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第27页,01,02,03,于,造模后第,3d,起开始用药，毛冬青甲素组舌下静脉注射,30mgkgd-1,，天天两次，连续给药,4,周。,毛冬青组,无干预办法,假手术组,干预办法,模型组,无干预办法,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第28页,增殖细胞标识,给药,25,天后，每组取,6,只，雌雄各半，将,Brdu,按照,50mg/kg,剂量，,10mg/ml,浓度溶于生理盐水，腹腔注射,2,次,/,天，每次间隔,2h,，其中最终一次在处死前,24h,注射。,动物处理,在给药后第,28,天，将大鼠用,10%,水合氯醛按,4mLkg-1,剂量腹膜麻醉。麻醉成功后，取仰卧位固定四肢。剖开胸腹充分暴露心脏与肝脏，剪开左侧心尖部，剪开右心耳，插导管于左心室并固定，穿刺针经左心室穿刺至升主动脉，快速灌注生理盐水至肝脏完全变白，右心耳流出完全清亮液体后，予,4%,多聚甲醛液灌注,先快后慢,，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意。然后将注射了,Brdu,大鼠开颅完整取出鼠脑，保留海马部位，切去多出部分，经后固定,48 h,后常规石蜡包埋。其余大鼠断头取脑，取出海马组织，投入液氮保留。,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第29页,海马组织细胞形态结构观察,采取,Nissl,染色法进行观察,海马增殖细胞检测,免疫组织化学检测,Brdu,标识增殖细胞,检测指标,采取免疫组化法检测海马组织中,BDNF,表示，采取分子探针检测,BDNF mRNA,表示情况。,脑源性神经营养因子检测,阿尔茨海默症动物模型专家讲座,第30页,