基因诊断和基因治疗.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,目录,第 二 十 一 章,基因诊疗与基因治疗,Genetic Diagnosis and Gene Therapy,基因诊断和基因治疗,第1页,基因,(gene),基因是为生物活性产物编码DNA功效片断，这些产物主要是蛋白质或各种RNA。,基因诊断和基因治疗,第2页,基因变异致病类型,内源基因变异,基因结构突变,基因表示异常,外源基因入侵,基因诊断和基因治疗,第3页,第 一 节,基因诊疗,Gene Diagnosis,基因诊断和基因治疗,第4页,（二）、分类,DNA诊疗以DNA为检测对象诊疗方法。,RNA诊疗以mRNA为检测对象诊疗方法。,一、基因诊疗概念和特点,（一）、定义,利用当代分子生物学和分子遗传学技术和方法，直接检测基因结构及其表示水平是否正常，从而对疾病作出诊疗方法。,基因诊断和基因治疗,第5页,（三）、特点,针对性强,特异性高,灵敏度高,适用性强，诊疗范围广,基因诊断和基因治疗,第6页,二、基因诊疗惯用技术方法,（一）、核酸分子杂交技术,（二）、聚合酶链反应,（三）、基因测序,（四）、基因芯片,（五）、DNA指纹,基因诊断和基因治疗,第7页,（一）、核酸分子杂交,(molecular hybridization),技术,核酸分子杂交,可用以检测样本中是否存在与探针序列互补同源核酸序列。,核酸探针,是一类含有放射性标识或化学标识并与目标目标DNA或RNA分子序列互补寡核苷酸片段。,基因诊断和基因治疗,第8页,探针,是能够同某种待研究核酸序列或蛋白多肽链特异结合任何分子，经标识之后可用来检测目标DNA/RNA 或蛋白质分子。,试验流程：,提取DNA(限制酶切)凝胶电泳膜转移杂交放射自显影分析,基因诊断和基因治疗,第9页,建立在核酸杂交技术基础上惯用基因诊疗方法,1、限制性内切酶(restriction endonuclease)酶谱分析法,2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析法,3、等位基因特异寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO)探针杂交法,基因诊断和基因治疗,第10页,1、限制性内切酶酶谱分析法,是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异一个方法。,基因诊断和基因治疗,第11页,Mst,酶切位点,(,C,CTN,A,GG),5,3,正常基因,5,3,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析,AT,基因诊断和基因治疗,第12页,+,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析,基因诊断和基因治疗,第13页,2、DNA-RFLP分析法,中性突变,是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异现象。,DNA多态性,是指中性突变造成个体间核苷酸序列差异。,限制性片段长度多态性,是指DNA多态性若发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不一样片段。,基因诊断和基因治疗,第14页,RFLP,分析法,基因诊断和基因治疗,第15页,3、ASO杂交法,依据已知基因突变位点核苷酸序列，人工合成对应于正常和突变基因碱基序列两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。,基因诊断和基因治疗,第16页,ASO杂交法,探针：M N M N M N M N,正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺点,（新突变类型？）,+,基因诊断和基因治疗,第17页,（二）、聚合酶链反应,(polymerase chain,reaction,PCR),是利用特异引物，特异地扩增目标DNA方法。,试验流程：,提取DNAPCR凝胶电泳显色分析,基因诊断和基因治疗,第18页,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,1、基本工作原理,基因诊断和基因治疗,第19页,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,2530 次循环后，模板DNA含量能够扩大100万倍以上。,基因诊断和基因治疗,第20页,2、,惯用,PCR,方法,：,常规PCR、巢式PCR、多重PCR、各种PCR、不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA差异显示PCR、原位PCR、实时PCR等等。,基因诊断和基因治疗,第21页,3、在PCR技术基础上惯用基因诊疗方法,PCR-SSCP,法,*,PCR-ASO,法,PCR-RFLP,法,PCR-,限制酶谱法,PCR-STR,（短串联重复序列，short tandem repeat）,基因诊断和基因治疗,第22页,SSCP是指相同长度单链DNA因其碱基序列不一样，甚至单个碱基不一样，都可能形成不一样空间构象，从而在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时泳动速率不一样现象。,单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP),基因诊断和基因治疗,第23页,PCR-SSCP分析,是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因迁移位置不一样，借此可分析确定致病基因存在。,基因诊断和基因治疗,第24页,正常人,纯合突变,杂合突变,Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析,（线粒体DNA第11778位GA所致）,+,基因诊断和基因治疗,第25页,（三）、基因测序(gene sequencing),即测定某一基因碱基序列。,试验流程：,提取DNA分离出相关基因测序分析诊疗,基因测序方法：,化学裂解法,DNA链末端合成终止法,DNA自动测序,基因诊断和基因治疗,第26页,（四）、基因芯片（gene chip),基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵列、寡核苷酸微芯片（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip）,是指将许多特定寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测标识样品基因按碱基配对原理进行杂交，再经过激光聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上荧光信号作出比较和检测，从而快速得出定性和定量结果。,基因诊断和基因治疗,第27页,基因诊断和基因治疗,第28页,基因芯片应用,1、在诊疗中应用,核酸序列分析、基因表示分析、寻找新基因、突变基因和基因多态性检测等,2、在药学研究中应用,药品筛选、药品作用机制研究、耐药菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化学毒物筛选、基因扫描等,基因诊断和基因治疗,第29页,（五）、,DNA,指纹,(DNA fingerprint),在人基因组,DNA,中有高度可变“小卫星”区域，采取“小卫星”基因探针，在同一限制酶切产物,DNA杂交,图谱上，同一个体不一样组织起源,DNA,谱带完全一致，而不一样个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同，如同人指纹含有高度个体特异性一样，所以这种,杂交,图谱被称为,DNA,指纹或遗传指纹,genetic fingerprint）,。,基因诊断和基因治疗,第30页,简言之：,DNA,指纹或遗传指纹是指,采取“小卫星”基因探针,进行,DNA,分子杂交,（Southern,印迹，,Southern blotting）,所得图谱。,试验流程：,提取DNA限制酶切凝胶电泳膜转移杂交放射自显影分析,基因诊断和基因治疗,第31页,三、基因诊疗应用,遗传疾病,肿瘤,感染性疾病,传染性流行病,判断个体疾病易感性,器官移植组织配型,法医学中个体识别、亲子判定,基因诊断和基因治疗,第32页,总结,基因诊疗概念、特点、惯用技术方法及应用。,基因诊断和基因治疗,第33页,复习题,1、名词解释：,基因诊疗、DNA诊疗、RNA诊疗、,RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指纹,2、简述基因诊疗特点、惯用技术方法及可用于诊疗疾病。简述基因变异致病类型及内源性基因变异类型。简述限制性内切酶谱分析法、ASO探针杂交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指纹等试验流程。,基因诊断和基因治疗,第34页,第 二 节,基因治疗,Gene Therapy,基因诊断和基因治疗,第35页,（一）、基因治疗概念,早期,是指用正常基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因一个治疗方法。,当前,广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以到达治疗疾病目标方法。,一、基因治疗概念,基因诊断和基因治疗,第36页,（二）、基因治疗基本方法,1、基因矫正(,gene correction,),2、基因置换(,gene replacement,),3、基因增补(,gene augmentation,),4、基因失活(,gene inactivation,),基因诊断和基因治疗,第37页,1、基因矫正(gene correction),指将致病基因异常碱基进行纠正，而正常部分给予保留。,纳米钳,基因诊断和基因治疗,第38页,A G C T G T G A A G T C G T G,T C G A C A C T T C A G C A C,abnormal,gene,Gene correction,normal,gene,T,A,C,G,基因诊断和基因治疗,第39页,2、基因置换(,gene replacement,),指用正常基因经过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内DNA完全恢复正常状态。,基因诊断和基因治疗,第40页,A G C T G T G,C,A A G T C G T G,T C G A C A C,G,T T C A G C A C,normal,gene,A G C T G T G C A A G T C G T G,T C G A C A C G T T C A G C A C,normal,gene,A G C T G T G,T,A A G T C G T G,T C G A C A C,A,T T C A G C A C,abnormal,gene,Gene replacement,基因诊断和基因治疗,第41页,3、基因增补(gene augmentation),将目标基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是经过目标基因非定点整合，使其表示产物填补缺点基因功效或使原有基因表示增强。,基因诊断和基因治疗,第42页,A G C T G T G,C,A A G T C G T G,T C G A C A C,G,T T C A G C A C,normal,gene,A G C T G T G,T,A A G T C G T G,T C G A C A C,A,T T C A G C A C,abnormal,gene,Gene augmentation,基因诊断和基因治疗,第43页,4、基因失活(gene inactivation),指将特定序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断一些基因异常表示，已到达治疗疾病目标。,基因诊断和基因治疗,第44页,几个常见基因失活技术,反义核酸技术,核酶技术,三链技术,干扰RNA技术,肽核酸,基因敲除,基因诊断和基因治疗,第45页,反义(antisence)核酸技术,是指用人工合成RNA或DNA来阻断基因转录或复制，使编码基因不能转录为mRNA，因而不能翻译成对应蛋白质。,基因诊断和基因治疗,第46页,反义RNA技术,反义RNA,是指与mRNA互补，且能抑制与疾病发生直接相关基因表示RNA。,反义RNA技术,是指利用反义RNA在mRNA水平上封闭基因表示，最终可经过调整剂量，来治疗由基因突变或过分表示所致疾病或严重感染性疾病。,基因诊断和基因治疗,第47页,T C G A C A C,A,T T C A G C A C,A G C T G T G,T,A A G T C G T G,abnormal,gene,Gene inactivation,abnormal,mRNA,U C G A C A C A U U C A G C A C,反义RNA,A G C U G U G,U,A A G U C G U G,Abnormal protein,Abnormal protein,基因诊断和基因治疗,第48页,核酶(ribozyme)技术,经过核酶分子结合到靶RNA分子中适当部位，形成锤头核酶结构，催化对靶RNA分子剪切，从而破坏靶RNA分子到达治疗疾病目标。,基因诊断和基因治疗,第49页,5,3,5,3,靶RNA,核酶分子,核酶技术,基因诊断和基因治疗,第50页,三链技术(triplex approach),又称为,反基因策略(antigene stragegy),，是利用脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，从而在转录水平或复制水平阻止基因转录或复制技术。,能形成三链DNA脱氧寡核苷酸称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide,TFO)。,基因诊断和基因治疗,第51页,复制、转录,三链DNA技术,基因诊断和基因治疗,第52页,干扰,RNA(interference RNA,RNAi),技术,RNAi,是指在特定因子作用下，有导入胞内双链RNA降解生成约22nt左右SiRNAs(single strand RNAi)。,RNAi技术,是指利用碱基互补配对标准，使RNAi和靶DNA结合，同时诱导激活体内基因缄默因子，从而使靶DNA降解。,基因诊断和基因治疗,第53页,dsRNA,RNAi-,DNA,RNA、DNA降解,干扰RNA技术,RNAi,基因诊断和基因治疗,第54页,RNAi技术特点,特异性强,效率性高,作用时间长,可经过细胞屏障而发挥作用,基因诊断和基因治疗,第55页,肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)技术,PNA,是指DNA-肽复合物。,PNA技术,是利用多肽与DNA特异性结合，专一地抑制某一基因表示。,基因诊断和基因治疗,第56页,肽,肽核酸技术,基因诊断和基因治疗,第57页,基因敲除(gene knock-out)技术,指有目标去除动物体内某种基因技术。,基因诊断和基因治疗,第58页,（三）、基因治疗其它方法,1、“自杀基因应用,一些病毒或细菌基因所表示酶能将对人体无毒或低毒药品前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而造成携带该基因受体细胞也被杀死，故称这类基因为自杀基因。,自杀基因,无毒、低毒药品前体,细胞毒性产物,细胞死亡,基因诊断和基因治疗,第59页,2、基因疫苗应用,将编码外源性抗原基因插入到含真核表示系统质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞内表示抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。,基因诊断和基因治疗,第60页,重组表示质粒,外源性抗原基因,基因疫苗,基因诊断和基因治疗,第61页,二、基因治疗基本程序,一、治疗性基因选择,目标基因选择,二、基因载体选择,三、靶细胞选择,四、基因转移,五、外源基因表示筛选,利用载体中标识基因,有,neo,r,标识基因时，用 418进行筛选,六、回输体内,静脉回输 自体骨髓移植,埋入皮下组织,病毒载体*,非病毒载体,体细胞,生殖细胞,间接体内疗法(ex vivo),直接体内疗法(in vivo),基因诊断和基因治疗,第62页,基因诊断和基因治疗,第63页,常见基因载体优缺点,载体 优点 缺点,逆转录病毒 基因组小而且简单 仅感染分裂细胞,稳定整合于宿主基因组 随机整合可能造成突变,生物学特征清楚 经常只有短暂表示,可高效转入复制中细胞 病毒滴度低107pfu/ml,对宿主无害 可能会于有复制能力病毒重组,腺病毒相关病毒 基因组小 未知,可特异整合于人染色体19q 需腺病毒辅助复制,以人细胞作为宿主 携带外源基因能力有限,无毒，无致病性 难得到高滴度病毒,基因诊断和基因治疗,第64页,腺病毒 适合用于原位使用，尤其是肺 不与宿主基因整合,在不分裂细胞中可进行高效率 只有短暂表示,体内感染 无特异性靶细胞,病毒滴度高1010pfu/ml 病毒蛋白可引发免疫反应和炎症反应,生物学特征清楚 插入外源基因能力有限,脂质体 无感染能力 无特异性靶细胞,理论上无DNA大小限制 转染效率低,毒性低 仅有短暂表示，体内应用困难,受体介导转运 无感染能力 转染效率低,特异性转染靶细胞 体内应用困难,理论上无DNA大小限制 可能有免疫原性,构建灵活 只有短暂表示,载体 优点 缺点,基因诊断和基因治疗,第65页,三、基因治疗应用与展望,(一）、应用,遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病,1、是单基因缺点病,2、是体细胞病,3、靶细胞易获取、培养、操作、回输,4、治疗效果甚于危害,5、无需严格表示水平调控,6、动物试验证实符合严格安全标准,基因治疗研究病种应该符合条件,基因诊断和基因治疗,第66页,(二)、展望,深入寻找切实有效基因,精密调控外源基因在人体内表示,构建安全、高效、靶向、可控载体,体细胞移植和重建生物学研究,降低外源基因对机体不利影响,基因诊断和基因治疗,第67页,本节重点提醒,基因治疗概念、方法、基本程序,基因诊断和基因治疗,第68页,