计算机模拟计算.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,计算机模拟计算,概念,概念,确定基因序列,设计引物,选择内切酶,电 泳,基 因 型,Step by step,基因序列查找,Exon 1,Exon 2,Exon 3,Promoter,gDNA,cDNA,Promoter,基因序列查找,基因序列查找,选择,gene,输入基因名称,基因序列查找,基因得全称,基因得物种来源,基因序列查找,cDNA序列,gDNA序列,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,基因序列查找,序列,如何详细区分每一个外显子和内含子？,基因序列查找,基因序列查找,外显子,全序列,基因序列查找,包含有该外显子得序列,该外显子得全序列,基因序列查找,起始密码子,外显子,内含子,启动子？,启动子序列查找,先免费,注册,登录,启动子序列查找,启动子序列查找,选择Gene2Promoter,启动子序列查找,选择物种,基因得名字,启动子序列查找,提交,选择您得基因,继续,启动子序列查找,启动子序列查找,可以选择就是否,分析该启动子,不同颜色代表该启动子序列得可靠性,金黄色代表实验研究证明,启动子序列查找,开始分析,启动子序列查找,继续提交,点击获,得序列,启动子序列查找,启动子序列查找,详细序列,如何确定我得SNP位置,C218A:外显子编码方式,rs431898:pubmed SNPs数据库编号,C-256A:启动子编码方式,如何确定我得SNP位置,ATG得A就是第一位,C218A,C-256A,如何确定我得SNP位置,选择SNP选项,输入编号,rs、,如何确定我得SNP位置,该SNP附近得序列,关于该SNPs得详细信息,如何预知我得SNP得功能意义,输入蛋白得名称,如何预知我得SNP得功能意义,如何预知我得SNP得功能意义,如何预知我得SNP得功能意义,结构域,名称,起止氨基酸编号,该结构域得氨基酸长度,如何预知我得SNP得功能意义,多态性,包括SNPs,定点诱变研究氨基酸得改变,就是否有功能意义,基因序列查找,更多序列查找方法、查找途径、数据库信息和序列比对,请参考,引物设计,引物设计,引物一般原则,基本原则:,1、引物要跟模板紧密结合,2、引物与引物之间不能有稳定得二聚体或发夹结构存在,3、引物不能在别得非目得位点引起DNA聚合反应(即错配)。,需要考虑得因素:,引物长度(primer length)、,产物长度(product length)、,序列Tm值(melting temperature)、,G值(internal stability)、,引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin),错误引发位点(false priming site)、,引物及产物GC 含量(position),引物一般原则,引物得长度:,15-30bp,常用得就是18-27bp,太短:特异性不好 太长:延伸温度大于Taq酶得最适温度,引物末端要求:,3端得序列要比5端重要,引物3端得碱基一般不用A,A在错误引发位点得引发效率相对比较高,5端序列对PCR 影响不大,常用来引进修饰位点或标物。,引物得GC含量:,一般为40-60%,以45-55为宜,两条引物之间得GC含量不宜相差太大,引物一般原则,Tm 值:,尽量保证两条引物得Tm值相匹配。最,好相差不要大于5 度,引物二聚体及发夹结构得能量:,绝对值一般不要超过4、5,最好不要位于3末端,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行,如果在5末端对反应就没有多大得影响了,G值:,反映了引物与模板结合得强弱程度。一般情况下,引物得,G值最好呈正弦曲线形状,即5端和中间G值较高而,3端G值相对较低,且不要超过9。如此则有利于正确引,发反应而可防止错误引发,PCR-RFLP 引物特殊要求,PCR产物得长度:200-1000bp,酶切后产物片断得大小差距:100bp以上,引物设计,工欲善其事,必先利其器,Primer Premier 5、0,引物设计,Oligo 6、0,引物评价,引物设计,新建窗口,输入序列,Primer Premier 5、0,突变位点,选取突变位点前后约500bp长度得碱基,Primer Premier 5、0,引物设计,酶切位点分析,Primer Premier 5、0,自动搜索引物,手动编辑引物,Primer Premier 5、0,前引物得位置(必须超过突变位点),后引物得位置(必须在突变位点之后),PCR产物得长度,引物得长度,Primer Premier 5、0,引物得综合评分,分越高引物越好,引物得详细信息,引物序列,Primer Premier 5、0,发夹结构,二聚体,错配,交叉二聚体,Primer Premier 5、0,更高级应用:,参数得设置,手动搜索或者修改引物,搜索特殊引物(比如单条引物得搜索等),Oligo 6、0,新建窗口,输入前引物,Oligo 6、0,输好以后点击Accept,Oligo 6、0,点击Upper,使之成为前引物,Oligo 6、0,点击Lower Primer,输入后引物,输入后引物,注意方向,Oligo 6、0,Oligo 6、0,点击Accept and Close,Oligo 6、0,前引物,后引物,Oligo 6、0,引物分析菜单,Oligo 6、0,前引物二聚体,Oligo 6、0,G值,呈正弦曲线形状,Oligo 6、0,更高级应用:,引物得设计,手动搜索或者修改引物,引物得更专业评价,引物纯化方式得选择,去盐(RPC,、Desalted,)纯化,她就是一种对DNA有特异性得吸附得树脂,能有效地去除,盐分及小片段得DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、,DNA测序等实验。,PAGE纯化,PAGE 纯化法就是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA,片段进行分离,然后从凝胶中回收目得DNA得方法。PAGE,纯化法也就是一种非常有效得DNA纯化方法,纯化 后得纯度,大于95%,对长链OligoDNA(大于50mer)得纯化特别有效。,适用于PCR用引物(如定点诱变引物),DNA测需用引物,各种探针等。,HPLC纯化,采用高效液相色谱纯化,产物纯度极高,可达99%。,适用于各种基因工程试验,特别就是:荧光标记DNA、,长链DNA、PCR克隆,定点突变,人工合成基因等。,几种特殊类型得引物设计,引入酶切位点引物设计,Takara定点诱变试剂盒 定点诱变引物设计,Quikchange定点诱变试剂盒 定点诱变引物设计,引入酶切位点引物设计,为什么要引入酶切位点？,突变位点没有内切酶或者合适得内切酶,通过人为得在引物上改变一个碱基从而使之与突变位点得碱基构成新得酶切位点,引入酶切位点引物设计,tctcaacaaaa,T,caaaactgtaag,突变位点,找不到合适得内切酶,tctcaacaGaa,T,caaaactgtaag,Hinf I,可以使用PCR-RFLP得方法基因分型,引入酶切位点引物设计,基本原则:,人为改变原序列上得一个碱基从而与突变位点得碱基构成新得合适得酶切位点,具体要求:,内切酶得选择:便宜、条件稳定和常用。,引物得位置:引物3端得最后一个碱基一定不能超过突变位点,改变酶切位点得位置:尽量远离突变位点,最好不要紧邻突变位点,一般相隔2-3个碱基,引物得长度:在保证引物质量得前提下,尽可能得加长引物得长度。最好不要小于20bp,引入酶切位点引物设计,5、PCR产物得长度:最好能位于100-200bp之间,琼脂糖凝胶电泳时更好区分。,6、突变位点附近得引物设计受限,因此,另外一条引物应该尽量设计好。,7、在有多种内切酶可供选择时,尽量选择切频率高得基因型得内切酶。以提高灵敏度。,引入酶切位点引物设计,5,GCCTGGATTCAGAATGATTCTCTTC 3,5 TACTGACCTTCTCGCCAATCTCTGT 3,改变位点,引入酶切位点引物设计,5,TCAGATGACACCTCTCAACAGAA 3,5,CCAGTTTTCACCTCCCACATTAT 3,改变位点,5 TCCTCGTGTGGGTGCCTG 3,5 GACTTACAGTTTTGGTTTTGTTGAT 3,改变位点,5 TCCTCGTGTGGGTGCCAT 3,5 GACTTACAGTTTTGGTTTTGTTGAT 3,改变位点,引入酶切位点引物设计,定点诱变引物设计(一),定点诱变引物设计(一),定点诱变引物设计(二),5-ggattcagaatgattctctcc,a,agaaaacatcctttttggatg-3,3-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-5,酶切位点分析,新建窗口,酶切位点分析,输入序列,注意粘贴得序列不能有空格和段落标记符号,大写突变位点以便于辨认,酶切位点分析,选择菜单,Analyze,Restriction maping,酶切位点分析,酶谱选择,点击确定,酶切位点分析,可供选择得限制性内切酶,酶切位点分析,酶切位,点个数,酶切位置,酶切后片断大小,