《基因表达》第七章--基因工程简介.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章,基因工程简介,Gene Engineering,人工进行基因切割、重组、转移和表达的技术。,按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就被称为“基因工程”，或者称之为“遗传工程”。,基因工程,1,相关概念,克隆（,clone,）：,来自同一原始的相同副本或拷贝的集合。分子克隆（指,DNA,克隆）,工具酶,限制性核酸内切酶,逆转录酶,Taq(,Thermus,aquaticus,)DNA,聚合酶,DNA,连接酶等,载体（,vector,）：,能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整,DNA,分子，又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体,目的基因：应用重组,DNA,技术所要分离、获得的基因,cDNA,（,complementary DNA,）：,是指经反转录合成的，与,mRNA,互补的单链,DNA,基因组,DNA,（,genomic DNA,）,2,限制性核酸内切酶,限制性内切酶（,restriction,endonuclease,）,识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶,是细菌内存在的保护性酶，分为,I,、,II,、,III,三类。,II,类酶识别序列特点为回文结构,GGATCC ,CCTAGG ,限制性内切酶作用后产生两种末端：,钝性末端,（,blunt end,）,粘性末端（,sticky end,）,Hinc,II,3,载体（,vectors,）,质粒载体（,Plasmid,vecters,）,噬菌体载体,Cosmids,（,粘粒）,:,accept between 38 and 53 kb of DNA and since most,cosmids,are about 5 kb,between 33 and 48 kb of DNA can cloned in these vectors.,YACs,（,酵母人工染色体）,真核载体（,Eukaryotic vectors,）,克隆质粒载体的设计要求,独立于宿主基因组的自我复制性,容易从宿主细胞中分离,筛选标志,一般一个标志足够,含融合产物的需,2,个标志：,2,个抗生素抗性,蓝白斑筛选,多克隆位点（,mcs,）,氨苄抗性,?yes yes,四环素抗性,?,No,yes,B,X,B,B,B,X,Amp,r,ori,Amp,r,Tc,r,ori,抗性插入失活筛选,Amp,r,Tc,r,ori,pBR322,B,平板移植：用吸水纸或绒布将克隆从一个平板转到另一个平板,克隆转移,+,ampicillin,+,ampicillin,+,tetracycline,含,重组质粒的细菌克隆,Amp,r,ori,pUC18,（,3kb,）,(Multiple cloning sites,多克隆位点）,Lac promoter,lacZ,插入的,DNA,片段干扰,lacZ,基因的读框（,ORF,），,表达的无功能产物不能消化酶的底物,x-gal,蓝白斑筛选：,lacZ,基因插入失活,lacZ,lacZ,：,一个缩短的,lacZ,，,编码,-,半乳糖苷酶,链的,N-,末端,宿主链带有一个突变的基因仅编码,-,半乳糖苷酶,C-,末端，因此可以弥补,链产物的酶活性,IPTG,X-gal,（酶的底物）,lac,启动子,蓝色产物,从诱导到指示标记,lacZ,编码的,-,半乳糖苷酶,空载体：蓝斑转化,空载体,(no insert),重组载体,(contain insert),含插入片段的重组载体：白斑转化,多克隆位点方便将目标基因插入到载体上,Amp,r,ori,pUC18,（,3kb,）,(,Multiple cloning sites,多克隆位点）,Lac promoter,lacZ,ACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA,.,Thr,Asn,Ser Ser Val Pro,Gly,Asp Pro,Leu,Glu,Ser,Thr,Cys,Arg,His Ala Ser,EcoRI,SacI,KpnI,SmaI,XmaI,BamHI,XbaI,SalI,HincII,AccI,PstI,SphI,Lac Z,4,表达载体（转录和翻译）,RNA,转录所需的启动子（,Promoter,）,和终止子（,terminator,）,翻译所需的完整读框（,ORF,）,和核醣体结合位点（,ribosomal binding sites,，,RBS,）,特殊的转录载体：,pGEM,系列含噬菌体,T7,、,SP6,的启动子，在适当的转录酶存在下允许体外转录（,pBluescript,with T7/T3,）,以,pUC18,为例，,插入基因的方向必须和,lacZ,的读框一致,产生的是包括,lacZ,N-,末端和插入读框一起的融合蛋白,质粒表达载体的启动子,lac,UV-5,：,一个,lac,启动子的强突变体，不依赖,cAMP,受体蛋白（,CRP or CAP,）,PL,的启动子,噬菌体,T7,的启动子,（,ribosome binding site,）,In,lysogen,E.coli,cells expressing T7 RNA polymerase,；,target protein up to 30%total protein,融合蛋白和融合标记,融合蛋白：,与,MBP,的融合（麦芽糖结合蛋白，,maltose-binding protein,）,与,GST,的融合（谷胱甘肽,S-,转移酶，,glutathione S-,transferase,）,与,GFP,的融合（绿荧光蛋白，,green fluorescent protein,）,融合标记,:,一般在,N-,末端或,C-,末端,组氨酸标记：通常是,6,个连续的组氨酸，可以用,Ni,2+,柱纯化表达的融合蛋白，在,E.coli.,里表达,5,目的基因的获取,1.,化学合成法,用于已知序列，或可推导出序列的基因,2.,基因组,DNA,基因组,DNA,文库（,genomic DNA library,）,3.cDNA,cDNA,文库（,cDNA,library,）,4聚合酶链反应（,polymerase chain reaction,，,PCR,）,基因组,DNA,文库：存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合，简称,G-,文库,cDNA,文库：用细胞总,mRNA,制备全套双链,cDNA,后，建立的基因文库，简称,c-,文库,PCR,的基本反应步骤,1.,变性：将反应系统加热至,95,，使模板,DNA,完全变性成为单链；,2.,退火：将温度下降至,50,左右，使引物与模板,DNA,退火结合；,3.,延伸：将温度升至,72,，,DNA,聚合酶以,dNTP,为底物催化,DNA,的合成反应,上述三个步骤为一个循环，经,25,35,次循环后，可将模板,DNA,扩增达百万倍,6,基因差异表达的研究,基因芯片（高密度）,高通量的研究：可以在基因组水平对上万条基因进行同时研究,发现基因之间表达的相关性,分析方法：,上调和下调,聚类分析,生物芯片的分类,DNA,芯片,cDNA,芯片,Oligo,芯片,microarray,蛋白芯片,组织芯片,微流体,芯片实验室（,Lab-on-a-chip,）,多点斑点杂交,Southern,杂交,Northern,杂交,斑点杂交,基因芯片,基因芯片的产生与发展过程,数据分析,、,寻找差异表达的基因,Cy3,标记的,A,组织,mRNA,Cy5,标记的,B,组织,mRNA,混合靶基因,以两种波长的激光扫描,cy3-532nm,cy5-635nm,杂交,基因表达检测原理,探针,正常组织,病理组织,7,基因多态性的检测,探针：,1.CTACTCA,T,GCGTACT,2.CTACTCA,G,GCGTACT,3.CTACTCA,C,GCGTACT,4.CTACTCA,A,GCGTACT,靶序列,CTACTCA,T,GCGTACT,和,CTACTCA,C,GCGTACT,DNA,芯片制备方法,原位合成法,预合成点样法,基因芯片,点样仪,探针的固定,Detector,Confocal pinhole,Filter,Laser beam,Substrate,Objective lens,Detector lens,激光共聚焦扫描仪的原理,ScanArray,扫描仪,基因芯片的应用,基因表达,基因结构,基因表达谱,寻找差异表达的基因,基因多态性,突变检测,谢 谢！,