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发酵工程知识点
第一章 发酵工程概述
一、发酵工程：是利用微生物特定的形状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用与工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。
二、发酵工程简史：

1590 荷兰人詹生制作了显微镜
1665 英国人胡克制作的显微镜观察到了霉菌
近代发酵工程建立初期 1864 巴斯德灭菌法
1856 psateur 酵母导致酒精发酵
19世纪末 Koch 纯种分离和培养技术

三、发酵工程技术的特点
（1） 主体微生物的特点
①微生物种类繁多，繁殖速度快、代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株；
②微生物酶的种类很多，能催化各种生化反应
③微生物能够利用有机物、无机物等各种营养源
④可以用简易的设备来生产多种多样的产品
⑤不受气候、季节等自然条件的限制等优点
（2） 发酵工程技术的特点
①发酵工程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应能够在发酵设备中一次完成
②反应通常在常温下进行，条件温和，耗能少，设备简单
③原料通常以糖蜜，淀粉等碳水化合物为主
④容易生产复杂的高分子化合物
⑤发酵过程中需要防止杂菌污染
(3) 发酵工程反应过程的特点
①在温和条件下进行的
②原料来源广泛，通常以糖、淀粉等碳水化合物为主
③反映以生命体的自动调节形式进行（同（2）①）
④发酵分子通常为小分子产品，但也很容易生产出复杂的高分子化合物

四、发酵工程的一般特征
①与化学工程相比，发酵工程中微生物反应具有以下特点：
作为生物化学反应，通常在常温常压下进行，没有爆炸之类的危险，不必考虑防爆问题还有可能使一种设备具有多种用途
②原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，加入少量的各种有机或无机氮源，只要不含毒，一般无精制的必要，微生物本身就有选择的摄取所需物质
③反应以生命体的自动调节方式进行因此数十个反应过程能够像单一反应一样，在称为发酵罐的设备内很容易进行
④能够容易的生产复杂的高分子化合物，是发酵工业最有特色的领域
⑤由于生命体特有的反应机制，能高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的氧化还原官能团导入等反应
⑥生产发酵产物的生物物质菌体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质，因此除特殊情况外，发酵液等一般对生物体无害。
⑦发酵生产在操作上最需要注意的是防止杂菌污染。进行设备的冲洗、灭菌，空气过滤等，使全过程在无菌条件下运转
⑧通过微生物的菌种改良，能够利用原有生产设备使生产飞跃上升

五、发酵罐的类型
1. 按微生物生长：厌氧和好氧发酵设备
2. 按发酵罐设备特点：
1）机械搅拌通风发酵罐
循环式：伍式、文氏管式发酵罐 非循环式：通风式、自吸式发酵罐
2）非机械搅拌通风发酵罐
循环式：气提式、液提式发酵罐 非循环式：排管式、喷射式发酵罐
3. 按溶积分类
50L以下的是实验室发酵罐
50~5000L是中试发酵罐
5000以上是生产规模的发酵罐
4. 按微生物生长环境
悬浮生长系统 支持生长系统
5. 按操作方式
分批发酵和连续发酵

. 常见发酵设备的类型
1. 机械搅拌发酵罐
利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液混合并溶解在发酵液中，基本要求：
1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高
2）能耐受一定的压力
3）搅拌通风装置
4）足够的冷却面积
5）罐内要减少死角
6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露
2.自吸式发酵罐
最关键的部件是带有中央吸气口的搅拌器
浸在发酵液中的转子迅速旋转，液体和空气在离心力作用下被甩向叶轮外缘，中心形成负压
转子的空膛与大气相通
发酵罐外的空气通过过滤器不断被吸入
转子的搅拌使气体分散
3. 空气带升环流式发酵罐
在罐外装设上升管，上升管两端与罐底与罐上部相连接，构成一个循环系统.
在上升管的下 部装设空气喷嘴，以250~300 m/s的高速喷入上升管。
借助喷嘴的作用将空气分散。
分为内环流式和外环流式两种。
4. 高位塔式发酵罐
罐内装有若干块筛板。
压缩空气由罐底导入，经过筛板逐渐上升，并带动发酵液同时上升。
上升后的发酵液又通过筛板上带有液封作用的降液管下降而循环。
特点：
培养基与操作合理，基本上可达到通用式发酵罐的水平。

六、 发酵工程中常见的发酵类型
（1） 液体发酵与固体发酵
（2） 厌氧发酵与好氧发酵
（3） 分批发酵与连续发酵
（4） 单一纯种发酵与混合发酵
（5） 固定化发酵技术

①试管液体培养 仅适用于培养兼性好氧菌
实验室常见的液体发酵方式
②浅层液体培养 仅适用于兼性好氧
③摇瓶培(旋转式和往复式) 被应用于微生物的生理生化试验
④台式发酵罐

①浅盘培养

工业生产中常用的液体发酵方式
②发酵罐深层培养

生产中常见的固定培养

实验室常见的固定化培养 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁平和茄子瓶斜面等固体培养方法，用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。用接种针挑取原始培养物后，在固体培养基表面划线接种

（未）分批发酵：分批发酵又称分批培养。所谓分批发酵是指将所有的物料一次加入发酵罐，然后灭菌、接种培养，最后将整个罐的内容物放出，进行产物回收。清罐结束后，重新开始新的装料发酵的发酵方式。
（未）连续发酵：是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养液，同事以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。 分类：具有菌体再循环或不循环的单罐连续发酵，具有菌体再循环或不循环的多罐连续发酵

第二章 微生物菌种选育
一、菌种的来源
二、工业发酵中常见微生物的种类

枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
乳酸杆菌
丙酮丁醇梭菌
①细菌 假单胞菌（可以利用烃类产生单细胞）
醋酸杆菌
棒状杆菌
黄单胞菌（产生黄原胶）

酿酒酵母（啤酒酵母）
异常汉逊式酵母
② 酵母菌 假丝酵母
毕赤式酵母

根霉属
③ 霉菌 曲霉属 ④放线菌⑤担子菌⑥藻类
青霉属
毛霉属

三、工业微生物的来源（菌种来源） 需要补充
①向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株 ②自然环境中分离 ③从发酵制品中分离目的菌株

四、微生物菌种的选择性分离
菌株的分离和筛选一般可以分为（采样）、（富集）、（分离）、（目的菌的筛选）等几个步骤。
(1)微生物样品的采集 控制培养基的营养成分：
(2)微生物样品的富集培养 控制培养条件：pH 温度 与通气量
抑制不需要的菌类
（3） 目的菌种的分离 ：透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法、
（4） 目的菌种的筛选 ：涂布法、影印平板法
（5） 自然界分离微生物的一般操作步骤？ 
（6） 样品的采取→预处理→培养→菌落的选择→初筛→复筛→性能的鉴定→菌种保藏 
五、发酵高产菌株的选育方法
自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程育种
六、常用的菌种保藏方法、原理以与各自的适用对象
原理：采用低温干燥缺氧、缺乏营养，添加保护剂或酸度中和剂等方法，使微生物处于代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
（1） 蒸馏水悬浮法：好氧性细菌和酵母菌
2） 斜面传代保藏：放线菌、酵母菌
（3） 霉菌矿物油浸没保藏：丝状真菌、酵母菌、细菌、放线菌、担子菌（各类菌）
（4） 干燥载体保藏（沙土管保藏）：产孢子微生物
（5） 冷冻干燥法（超低温冷冻保藏、普通冷冻保藏、液氮冷冻保藏）：各大类
六、菌种复壮定义：狭义菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的。广义：在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识的进行菌种分离和生产性能的测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。
七、纯种分离的方法（稀释分离法）（平板划线法）（组织分离法）
八、种子的扩大培养：是指将保存在砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶与种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物成为种子。
细菌孢子的制备
孢子制备 霉菌孢子的制备
实验室种子制 放线菌孢子的制备
备种子扩大培养 液体种子制备

生产车间种子制备
九、 影响种子质量的因素：（接种量）（种龄）（孢子的质量）（培养基）（培养条件）
影响孢子质量的因素：（培养基）（培养条件）（培养时间）（冷藏时间）
十、种子罐级数的确定：
种子罐是指：制备种子需要逐级扩大培养的次数，主要取决于两个方面
①菌种生长特性，孢子发芽与菌体繁殖速度
②所采用发酵罐的容积
十一、接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例
第三章 发酵机制与发酵动力学（需看课本代谢调节）
十二、 分批发酵和连续发酵的关系
十三 初级代谢产物和次级代谢产物的关系

 1、 概念不同 
在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢 
而次级代谢是相对于初级代谢而提出的一个概念。一般认为，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程  
2  产物不同 
初级代谢的产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以与由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。
通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型  
次级代谢产物可积累在细胞内，但通常都分泌到细胞外，有些与机体的分化有一定的关系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。
3  存在范围不同  
初级代谢的代谢系统，它是一类普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型。
次级代谢只存在于某些微生物中，并且代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。
4  对微生物的作用不同  
通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。  次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能，不参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，不是机体生长与繁殖所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍，也不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。但许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响  
5  同微生物生长过程的关系  
初级代谢自始至终存在于生活的菌体中，同菌体的生长过程呈平行关系，只有微生物大量生长，才能积累大量初级代谢产物  。次级代谢则是在菌体生长到一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为菌体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。 
 6  对环境条件的敏感性或遗传稳定性上明显不同 
初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环境条件变化而停止。  
7  相关酶的专一性不同 
 相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物 
 另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是在菌体对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，这些酶通常因环境条件变化而不能合成。
十四、 如何选育抗反馈调节的突变菌种
微生物生长时常需要一些代谢物如氨基酸、维生素嘌呤和嘧啶化合物等用于细胞的生物合成。如果将这些代谢物的结构类似物（抗代谢物）添加与培养基内，由于它们可以和正常的代谢物竞争同一酶系，因此使微生物不能够再将正常的代谢物用于细胞的生物合成，结果使菌体不能正常生长。如果将菌体诱变，获得在抗代谢物同时也能够正常生长的突变株，则证明给突变株的有关酶系对某抗代谢物已不敏感了。在一般情况下，该突变株的有关酶系对相应的代谢物也不敏感了，这样也就解除了某些代谢物对有关酶系的反馈抑制和阻遏。
十五、 分解代谢物阻遏（葡萄糖效应）
原因：大肠杆菌优先利用葡萄糖，并在葡萄糖耗尽后开始利用乳糖。葡萄糖分解的中间产物阻遏了分解葡萄糖酶系的合成。
第四章 发酵工业培养基与原料处理

一、 培养基要满足：满足菌的生长，促进菌的生成
二、 发酵培养基一般含有五大方面的要素：碳源、氮源、无机盐与微量元素、水，以与生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂等。 发酵培养基一般有三种分类方法，按原料的化学纯度不同分为：天然合成培养基、合成培养基和半合成培养基；按培养基的物理状态不同分为：固体培养基、液体培养基和半固体培养基；按培养基的用途不同分为：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基
三、 常用的碳源：葡萄糖、糖蜜、酯类、烃类、（淀粉、糊精 需要先糖化）
常用的氮源：氨水、蛋白胨、尿素
四、 工业发酵中培养基按照用途分 实验室常用培养基、发酵生产中常用培养基
选择培养基
实验室常用的培养基 鉴别培养基

孢子培养基
发酵生产中常用的培养基 种子培养基
发酵培养基

第五章
一、 常用的灭菌方法 ：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌
二、 求灭菌时间
三、 空气除菌的工艺流程（两次冷却 两次分离 适当加热）

预处理的目的：
提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的负荷；
除去压缩后空气中所带的油水，以合适的空气湿度和温度进入空气过滤器
六章
一、 影响发酵的原因与控制
（1） 营养基质和菌体浓度：碳源的种类和浓度；氮源的种类和浓度；磷酸盐的浓度；菌体浓度；
（2） 温度：生物热；搅拌热；蒸发热；辐射热；发酵热
（3） pH：使微生物细胞的原生质膜的电荷发生改变；直接影响酶活性；直接影响代谢过程
控制：添加碳酸钙法，氨水流加法，尿毒流加法，通过补料控制pH
（4） 通气和搅拌：微生物对氧气的需求（临界氧浓度，溶解氧）
（5） 泡沫：化学消泡，机械消泡
（6） 二氧化碳和呼吸商
控制：严格选择和控制最适温度。
泡沫控制的途径：调整培养基成分或改变某些物理化学参数或改变发酵工艺；采用机械消泡或消泡剂；采用菌种选育的方法筛选不产生流态细胞的菌种。
染菌的原因与控制
种子带菌，空气系统带菌，夹套穿孔，盘管穿孔，操作问题，补料取样带菌，培养基灭菌不透。
控制：

发酵优化的控制

表型延迟：指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，避免长出不纯的菌落。
诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便快捷和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产和研究。
生长因子：是一类对微生物必不可少的物质，一般为一些小分子有机物，需求量很小。
假菌丝：
富集培养：是指在目的微生物样品含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速生长繁殖
菌种复壮：

连续培养：以一定的速度向培养基内添加新鲜培养液，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养基的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。
碳氮比：是非常重要的一个营养比列关系。碳氮比指的是培养基碳源中的碳原子摩尔数与氮源中氮源子摩尔数之比。
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