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医学微生物学与免疫学实验
医学微生物学及免疫学实验
                  实验目的和要求
一、实验前务必做好预习，明确实验目的、内容及理论依据等，避免或减少错误的发生，以保证实验在预期内完成。
二、实验操作严格按要求进行，严防污染和感染。
三、对示教实验联系理论认真观察。对光镜下标本不得擅自挪动视野，其他示教标本看后必放回原处。对录像教学应作重点、简要的笔记。
四、客观真实地记录实验结果并进行分析，若及理论不符，要加以分析讨论，找出原因，必要时重复实验。
五、在规定时间内完成实验报告，报告要求字迹清楚，说明问题简单扼要。

                    实验室规则
1. 非实验必需品禁止带入实验室。
2. 穿白大衣，按规定就坐。
3. 实验室应保持安静和良好的秩序，不得高声谈笑、乱动物品或随便走动。
4. 实验室内严禁吸烟、进食、饮水或用嘴湿润铅笔和标签等，也不要用手搔抓抚摸机体。
5. 实验时若不慎发生皮肤创伤，或病原菌污染衣物、卓（地）面等事故，应立即报告指导老师，进行紧急处理。
6. 实验所用的玻片、试管、吸管等，用后应随即投放盛有消毒剂的指定容器内，不得放在桌上，也不可在水池中冲洗。
7. 每次实验完毕，按实验要求应及时清理实验物品，清扫卫生；离开实验室时，消毒洗手后离开实验室；对白大衣经常清洗消毒。

                 油镜的使用和维护
目的：掌握油镜的使用及维护，熟悉油镜的使用原理。
材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯
原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片及镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。
步骤：显微镜油镜的使用和维护
1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。
2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。
3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。
4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。
5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。
6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。

                     革兰染色
目的：掌握革兰染色的原理及操作。
材料：干净玻片，接种环葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液
原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。
步骤：
1. 细菌标本的制作
（1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。
（2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。
（3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是杀死细菌，使细菌及玻片黏附较牢固。菌体蛋白质变性后，提高及染料的亲和力。
2. 革兰染色
（1）初染：滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上，1min钟后用自来水缓缓冲洗。
（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自来水缓缓冲洗。
（3）脱色：加95%酒精数滴，摆动玻片使酒精及细菌充分接触，约20-30s后，立即用自来水缓缓冲洗。
（4）复染：滴加稀释碳酸品红液，30-60s后，自来水缓缓冲洗。
用吸水纸吸干后，用油镜观察。镜检后，载片放入消毒缸。

                 细菌特殊结构的观察
目的：观察并掌握细菌的形态及特殊结构。
材料：细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片；革兰阳性菌、革兰阴性菌染色标本片
示教：
革兰阳性菌：葡萄球菌，紫色
革兰阴性菌：大肠杆菌，红色
细菌鞭毛
细菌芽孢
细菌荚膜

                    细菌的分布
目的：了解细菌在自然界中的分布情况。
材料： 普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。
操作步骤：
1.空气中细菌的检查
（1）采用沉降法：取普通琼脂平板培养基1只，任意置一处，启盖约15分钟，再盖上，37℃培养24小时，观察有无细菌生长。 
（2）结果判定：培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。
2. 皮肤表面细茵检查
(1)采用涂抹法: 先在平板底面用记号笔分成两区，作标记，将未消毒的手指在平板的1／2处表面轻轻涂抹划线，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤，用消毒后的手指在平板另一1／2处进行涂抹，操作完毕，置37℃培养24小时后，取出观察结果。
(2)结果判定：培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长，注意比较消毒前后细菌的生长情况。   
3.咽喉部细茵检查
(1)用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并划线分离，37oC培养24小时后观察结果。注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象，并可挑取菌落进行革兰染色检查。口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢，制成涂片，进行革兰染色检查。
(2)结果判定：血平板表面有大小和形态不同的菌落，有的菌落周围可见溶血环。牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。

                  紫外线杀菌实验
目的：掌握紫外线杀菌的原理，熟悉紫外线杀菌实验的操作。材料：大肠杆菌，琼脂平板，无菌回形状纸片，接种环，镊子，紫外灯.
原理：紫外线波长范围为240～280nm,最适的波长为260nm，这及DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。紫外线特点：紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃。
步骤：
1.平板密集划线接种。
2.在平板上贴无菌回形纸片。
3.UV照射30min（打开平板盖子）。
4.取出回形纸，将回形纸放入消毒缸中。
5.37℃培养24h后观察结果。

                   培养基配制
目的：掌握细菌生长的营养成分。熟悉培养基的配制。
材料：培养基配制的原材料
示教：培养基配制过程。

            细菌代谢产物观察和生长现象
目的：掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。
材料：各种生化管，大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。
原理：不同菌的酶系统不同，对底物的代谢产物也不同，用生化的实验方法可将产物检测出来，从而对细菌鉴定。
步骤：
一、细菌代谢产物观察
1. 糖发酵实验
    将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内，37℃培养18-24h进行观察。培养基中指示剂为溴甲酚紫。
如能分解葡萄糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。
如能分解乳糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。如培养基未变色，仍为紫色，则表明细菌不能分解乳糖不能分解乳糖。记录符合“-”。
2.枸橼酸盐利用实验
该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。指示剂是澳麝香草酚兰。分别接种大肠杆菌和产气杆菌，37℃培养24h进行观察.
若斜面有菌落出现，培养基由原来的绿色变为深兰色，表明细菌能利用枸橼酸钠，记录符合“+”，反之“-”。
3.靛基质吲哚产生实验
能产生色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质。将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，37℃培养48h后，每管各加吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出现红色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基质产生阳性“+”；反之为阴性：“-”。
4. 硫化氢产生实验
有的细菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢。将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的培养基中，37℃培养18-24h。若培养基中出现黑色沉淀物即为阳性“+”，表明产生的硫化氢及培养基中的铅盐(或铁盐)结合，生成黑色的硫化铅（或硫化铁）。
二、细菌生长现象
1、在液体培养基上生长情况
  (1)表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。如枯草杆菌。
  (2)混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。如大肠埃希菌。
  (3)沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。如链球菌。
2、在固体培养基上的生长情况 
(1)菌苔：在琼脂斜面培养基上长成菌苔。
(2)菌落：在平板上形成肉眼可见的细菌集团，称为菌落。观察时要注意菌落的大小、形状、表面形状、边缘是否整齐、透明度颜色等，可作为鉴别细菌的依据之一。
(3)色素：水溶性色素和脂溶性色素。
3、在半固体培养基上的生长情况  
有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性生长，使穿刺线变得模糊不清。无鞭毛的细菌，因为不能运动，接种生仍没穿刺生长，穿刺线及周围界限清楚。

                   高压蒸汽灭菌
目的：掌握高压蒸汽灭菌的原理及应用范围，了解高压蒸汽灭菌的操作。
材料：高压蒸汽灭菌器。
原理：高压蒸气灭菌器是一种坚固密闭的蒸锅，锅盖上装有压力计、安全阀及排气孔
等。锅盖密闭旋紧后由锅底加热，因蒸气不能外溢，可使锅内压力逐渐增高，从而提高了锅内水的沸点和蒸气的温度。由于高压蒸气的温度较高，放出潜热多，热力穿透能力较强，故其灭菌效能最好。凡能耐热和耐潮湿的物品如培养基、生理盐水、纱布、玻璃器材等都可以应用此法消毒灭菌。
讲解（示教）
高压蒸汽灭菌器的主要构件：一个能密闭的耐高压的双层金属圆筒，蒸汽压力计，安全阀，排气阀等。
步骤：
1.先向外筒注入一定量水，需灭菌物品装入内筒，不宜拥挤，以便蒸汽充分回旋。把筒盖拧紧盖严，打开排气阀，开始加热。
2. 水沸腾后，排气阀打开排出气体，待排气孔急促排出蒸汽，表明冷空腔已排尽，关闭排气阀，此时筒内压力逐渐上升。
3. 待压力达到所需值时，适时调节热源，使维持一定时间。一般为15磅，温度121.3℃，维持15-30min。
4. 灭菌达到所需时间后，关闭热源，自然降压（温），待压力表指针降至“0”时，方可开盖取物。
注意事项：
1.器内的水量适当。
2.放入的物品不拥挤。
3.排尽冷空气。
4. 待压力表指针降至“0”时，方可开盖。

                  凝集实验（玻片法）
目的：掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉凝集反应的操作。
材料：伤寒杆菌A－F群O多价血清、志贺氏痢疾多价血清、生理盐水、未知菌、玻片。
原理：颗粒性抗原（凝集原）及相应的抗体（凝集素）直接结合，在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现象。如红细胞ABO血型的测定，测定细菌的细菌凝集实验。
步骤：
1.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。于第一格和第二格内各加约30ul伤寒杆菌A－F群O多价血清及志贺氏痢疾多价血清，第三格内滴加约30ul生理盐水。
2. 用接种环挑取待检菌种少许，分别均匀地涂抹于1、2、3格内的液体中。接种环每次使用前后均需经酒精灯火焰烧灼灭菌。
3. 轻轻摇动玻片，数分钟后用肉眼观察结果，出现灰白色凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。

                  沉淀反应（双扩散）
目的：掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉沉淀反应的操作。材料：干净玻片，玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清IgG、羊抗人IgG
原理：将抗原及抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两孔中，抗原及抗体双方自由扩散，在最适当比例处形成抗原抗体复合物（沉淀线）。
步骤：
1.制板：取干净玻片一片，用蜡笔分为三格，用吸管将4－5ml加热溶化的1.5%食盐琼脂充盈中格，制备琼脂板。
2. 打孔：待琼脂板凝固后，用打孔器打孔。孔间距约为5mm。
3. 封底：将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。
4. 加样：用微量加样器在三孔中加入生理盐水，正常人血清IgG和马抗人IgG。每孔加入约10μl。注意：加样时勿使液体溢出和孔内出现气泡。
5. 扩散：将琼脂板放入湿盘内，置37℃温箱中（均保持水平位置），于24小时后观察结果。

            ELISA（乙肝病毒表面抗原的检测）
目的：掌握ELISA的原理，用途，熟悉其操作过程。
材料：乙肝病毒表面抗原的检测试剂盒、待检血清、微量加样器等。
原理：将酶及抗体（或抗原）用交联剂结合起来，此种酶结合物能及相应的抗原（或抗体）发生特异性结合反应，形成酶-抗原抗体大分子复合物，此时再加入酶底物，底物被酶催化生成有色产物，最后借助反应体系的颜色变化及呈色深浅来推断样品中检测对象的有无或含量。
步骤：
1．加待检患者血清：0.05ml /孔，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔。
2．加HBs－HRP：0.05ml /孔，空白对照不加，充分混匀，置37℃ 30min。
3．洗板：弃去反应板孔内液体，拍干；用洗涤液注满各孔，静置5－10sec，弃去孔内洗涤液，拍干，如此反复5次，拍干。
4．加显色剂：先加显色剂A，0.05ml /孔；再加显色剂B，0.05ml /孔；充分混匀，置37℃ 避光15min。
5．终止反应：每孔加终止液0.05ml /孔，混匀。
6．测定：
1）目测法：及阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅作出判断
2）用酶标仪读取各孔OD值。

                  药敏实验(纸片法)
目的：掌握纸片法药敏实验方法，熟悉微生物培养，了解抗生素对细菌的作用机制。了解含药纸片的制备
材料：大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打孔器(直径6cm)，抗生素纸片。
原理：药物在琼脂上扩散，形成浓度涕度，在一定的浓度下，对细菌抑制或杀死，浓度过低，则不能抑制或杀死。从而形成一定大小的抑菌圈。
步骤：
1.平板上密集划线接种。
2.贴4-5种含抗生素的纸片于平板上。药片及平板边缘相距至少1.5cm，药片之间相距至少2cm。
3. 37℃培养24h后观察结果。测量抑菌圈直径大小，判断敏感性。

                  消毒剂对细菌的影响
目的：掌握含药纸片的制备。熟悉微生物培养，了解消毒剂对细菌的作用机制。
材料：大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打孔器(直径6cm)，滤纸纸片(直径约6 mm)，70%酒精，金星消毒水，紫药水、红药水。
原理：药物在琼脂上扩散，形成浓度涕度，在一定的浓度下，对细菌抑制或杀死，浓度过低，则不能抑制或杀死。从而形成一定大小的抑菌圈。
步骤：
1.平板上密集划线接种细菌。
2. 将无菌干燥的滤纸片放入各种消毒剂中浸湿，在容器边缘沥干，即为含药的滤纸片。
3. 将以上含药滤纸片贴于平板上，每块贴4种。药片及平板边缘相距至少1.5cm，药片之间相距至少2cm。
4. 37℃培养24h后观察结果。测量抑菌圈直径大小，判断抑菌效果。

                口服药物的微生物检查
目的：掌握口服药物的微生物检查指标,熟悉其操作过程。
一、细菌总数检测
材料：待检中成药片剂或丸剂，吸管、烧瓶、研钵、普通琼脂培养基、无菌生理盐水、试管、平板。
步骤：
1.称取一定量待检药物置于无菌研钵中，加入无菌生理盐水研磨，制成均浆，然后移入烧瓶内加足生理盐水，使之浓度成为1：10的均匀悬液。
2. 用1ml吸管吸取1：10药液1ml加入装有9ml的无菌生理盐水的试管内，得到1：100稀释液。依次在一排管内作10倍递增稀释。得到10-1、10-2、10-3、10-4等不同浓度的稀释液。
3. 选择适宜的几个稀释度进行测定   用1ml无菌吸管分别吸取所选浓度的各种稀释液加入到直接9cm的无菌平板中。每种浓度做3个平板，每个平板中加入1ml的稀释药液。将融化并冷却至50℃的琼脂培养基15ml倒入平板中，并立刻转动平板使药液和培养基充分混匀。冷却后的平板翻转，置37℃培养24-48h,取出计算每一平板中生长的菌落数，并求得每一稀释度的3个平板的菌落均数。
4.细菌总数报告   选取菌落平均数值在30-300个之间的平板作为菌落总数测定范围。将数得的菌落均数乘以相应稀释度即得到每克或每毫升监测药品中的细菌总数。
  稀释度的选择：
1.若只有一个稀释度，菌落均数在30-300个间，即乘以稀释倍数报告（见表中例I）。
2.若两个稀释度，菌落均数都在30-300个间，则求出两者每克或每毫升总均数之比，若比值小于2应报告其均数，若大于2则报告较多的数值（见表中例Ⅱ、Ⅲ）。
3. 若所有稀释度菌落均数多大于300个，取稀释度最高的菌落均数乘以稀释倍数报告（见表中例Ⅳ）。
4.若所有稀释度菌落均数均少于30个，取稀释度最低的菌落均数乘以稀释倍数报告（见表中例Ⅴ）。
5. 若所有稀释度菌落均数不在30-300个之间，一个稀释度大于300个，相邻另一稀释度小于30时，则以接近30-300个的菌落均数乘以稀释倍数报告（见表中例Ⅵ）。

细菌计数结果及报告方法
 菌落均数      稀释倍数        比值          菌落总数       报告方式
 例次     10-1   10-2  10-3                 (个/克或ml)     (个/克或ml)
 Ⅰ       1365   164   20        -            16400      16000/1.6×104
 Ⅱ       2760   295   46       1.6           37750      38000/3.8×104
 Ⅲ       2890   271   60       2.2           27100      27000/2.7×104
 Ⅳ    不可计   4650  513       -            513000     510000/5.1×105
 Ⅴ        27    11    5        -               270       270/2.7×102
 Ⅵ     不可计   305  12        -             30500     31000/3.1×104

二、霉菌总数的测定
材料：待检中成药片剂或丸剂，吸管、烧瓶、研钵、马丁培养基、无菌生理盐水、试管、平板。
步骤
1.称取一定量待检药物置于无菌研钵中，加入无菌生理盐水研磨，制成均浆，然后移入烧瓶内加足生理盐水，使之浓度成为1：10的均匀悬液。
2. 用1ml吸管吸取1：10药液1ml加入装有9ml的无菌生理盐水的试管内，得到1：100稀释液。依次在一排管内作10倍递增稀释。得到10-1、10-2、10-3、10-4等不同浓度的稀释液。
3. 取适宜稀释度的稀释液各1ml，分别加入无菌平板中，每个稀释度各做3个平板。
4. 将15ml融化并冷却至50℃的内含4/30000虎红的马丁培养基倒入平板中，充分混匀、凝固。
5. 将平板倒置，置25-28℃培养72h。计算平板内染成粉红色的霉菌菌落均数（如有根霉或毛霉生长，因其能蔓延生长而掩盖了其他菌落，应及时取出计数以免影响结果）。
6. 真菌的菌落计数时，先点清每个平板上生长的菌落数，再求出每一个稀释度的菌落平均数。判断结果时选取均值在5-50个范围以内的菌落数乘以相应稀释倍数后，作为真菌总数报告。若有两个稀释度的菌落均数皆在5-50个以内，或3个稀释度的菌落均数皆不在此范围内时，稀释度的选择可参照细菌总数测定时的稀释度选择规则。即以细菌菌落均值30-300个相对应于真菌菌落均值5-50个作为选择稀释度的参考标准。例如两个稀释度的真菌菌落均值都在5-50个范围内，稀释度选择可参照上面表中的例Ⅱ、例Ⅲ。

             外用药物的微生物学检测
目的：掌握外用药物微生物检查指标,熟悉其操作过程。
一、绿脓杆菌的检测
材料：待检药物、胆盐乳糖增菌培养基和其他培养基、必要的器械物品等。
步骤：
1.取1：10稀释的待检药品液10ml加入100ml胆盐乳糖增菌培养基或十六烷三甲基溴化胺肉汤培养基中，增菌培养18-24h。同时在另一管同一培养基（已加入待检药物）中加入标准阳性对照菌液0.1ml，内含约50-100个活菌作为对照实验。
2. 取上述增菌液面上的菌膜转种在十六烷三甲基溴化胺琼脂平板上。倒置，37℃培养24-48h。
3. 挑选扁平、表面湿润呈灰白色，周围有明胶液化环及培养基扩散有水溶性蓝绿色色素的菌落，进行革兰染色镜检和纯培养。绿脓杆菌应为革兰阴性菌。然后再进行生化反应，进一步证实。
4.氧化酶实验  细菌如有氧化酶能将二甲基对苯二胺脱氨而氧化成带红颜色的醌类化合物。实验时用接种环挑起可疑菌落涂布在滤纸片上，置于无菌平板内。在菌苔上添加数滴1%二甲基对苯二胺盐酸试剂液，如在30s内，纸片上菌苔变为粉红色，直至紫红色时，即为阳性。
5. 绿脓菌素实验   挑起纯培养物转种到绿脓菌素测定用的培养基（PDP培养基）上，37℃培养24h,加入3-5ml氯仿摇匀，使得色素溶解于氯仿内，待氯仿变为蓝绿色后吸到另一试管内，在该试管内加入1N（1mol/L）盐酸1ml,振摇后静置片刻，如果盐酸液变为粉红色为阳性反应。如不出现，可延长培养时间，2-3d再测试。
二、金黄色葡萄球菌检测
材料：待检药品及必要的器械物品，亚碲酸钠盐培养基和TMP高盐琼脂培养基。
步骤：
1.取待检药品（1：10稀释液）各10ml接种在2瓶含有100ml亚碲酸钠盐培养基上，置37℃培养24h进行增菌培养。其中1瓶同时加入含菌量为500-1000个/ml的标准金葡菌液0.1ml作为阳性对照。
2.取增菌培养物转种在TMP高盐培养基，37℃培养24-48h。
3. 挑起平板上墨黑色的可疑菌落，进行纯培养后做染色，镜检及生化反应。
4. 甘露糖发酵实验   用接种环挑起菌苔到甘露醇发酵管内，37℃培养后观察有无产酸产气。

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