分子生物学期末考试题目及答案.docx

分子生物学 复习提纲
一．名词说明
（1）Ori ：原核生物基因质粒的复制起始位点，是四个高度保守的19bp组成的正向重复序列，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制。
ARS：自主复制序列，是真核生物DNA复制的起点，包括数个复制起始必需的保守区。不同的ARS序列的共同特征是一个被称为A区的11bp的保守序列。
（2）Promoter：启动子，及基因表达启动有关的顺式作用元件，是结构基因的重要成分，它是位于转录起始位点5’端上游区大约100~200bp以内的具有独立功能的DNA序列，能活化RNA 聚合酶，使之及模板ＤＮＡ精确地相结合并具有转录起始的特异性。
（3）r-independent termination不依靠r因子的终止，指在不依靠r因子的终止反应中，没有任何其他因子的参及，核心酶也能在某些位点终止转录。（强终止子）
（4）SD sequence：ＳＤ序列（核糖体小亚基识别位点），存在于原核生物起始密码ＡＵＧ上游７～１２个核苷酸处的一种４～７个核苷酸的保守片段，它及１６ＳｒＲＮＡ３’端反向互补，所以可以将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
Kozak sequence：存在于真核生物mRNA的一段序列，核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
（5）Operator操纵基因，及一个或者一组结构基因相邻近，并且能够及一些特异的阻遏蛋白相互作用，从而限制邻近的结构基因表达的基因。
Operon：操纵子，是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。包括操纵基因, 结构基因, 启动基因。
（6）Enhancer：增加子，能强化转录起始的序列的为增加子或强化子
Silencer：缄默子，可降低基因启动子转录活性的一段DNA顺式元件。及增加子作用相反。
（7）cis-acting element ：顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子, 增加子, 调控序列和可诱导元件，本身不编码任何蛋白质仅仅供应一个作用位点，及反式作用因子相互作用参及基因表达调控。
trans-acting factor：反式作用因子，是指直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参及调控靶基因转录效率的蛋白质。具有三个功能结构域，即DNA结合域, 转录结合域, 结合其他结合蛋白的结构域。
（8）Open reading frame (ORF)：开放式阅读框架，是指一组连续的含有三联密码子的能够被翻译成为多肽链的DNA序列。它由起始密码子开始，到终止密码子结束。
（9）Gene：基因，产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。（能转录且具有生物学功能的DNA/RNA的序列。）
（10）DNA denaturation：DNA变性，DNA双链的氢键断裂，最终完全变成单链的过程。
Hyperchromatic effect：增色效应，在变性过程中，260nm紫外线汲取值先缓慢上升，当达到某一温度时隧然上升，称为增色效应。
复性（Renaturation)：热变性的DNA缓慢冷却，单链复原成双链。
DNA Melting temperature (Tm)：ＤＮＡ溶解温度，变性过程紫外线汲取值增加的中点称为融解温度。生理条件下为85~95℃。
(11) RNA splicing：ＲＮＡ的剪接，SnRNA形成剪接体，剪接信号为GU（供体）AG（受体）从mRNA前体分子中切除内含子，而使外显子拼接形成成熟ｍＲＮＡ的过程。
intron ：内含子，存在于原始转录产物或基因组DNA中，但不包括在成熟mRNA, rRNA或tRNA中的那部分核苷酸序列。
exon：外显子，基因组DNA中出现在成熟RNA分子上的序列。
(12) RNAi：RNA干涉，是利用双链小RNA的高效, 特异性降解细胞内同源mRAN，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型的方法。
(13) polymerase chain reaction (PCR)：聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性(92~97℃), 低温退火（45~55℃复性）及适温延长(72℃, Taq酶)等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以快速扩增。
(14) Southern blot：DNA印迹杂交，指利用具有肯定同源性的两条核酸单链在肯定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱，此即DNA印迹杂交。
Northern blot：RNA印迹杂交，首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过及特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
Western blot：蛋白质印迹。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达状况的信息。
二．简答和问答题
1．RNA的种类和功能
答：mRNA, tRNA, rRNA, 反义RNA, snRNA，ｇＲＮＡ等等。
①mRNA，信使RNA，功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，确定蛋白质的氨基酸顺序，完成遗传信息传递过程。
②tRNA，转运ＲＮＡ， 依据mRNA的遗传密码依次精确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。
③rRNA，核糖体ＲＮＡ，一般及核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体。
④反义RNA及mRNA互补的RNA分子，从而抑制mRNA的翻译，参及基因表达的调控。
⑤snRNA，小核RNA，是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体的主要成分。
上述各种RNA分子均为转录的产物，mRNA最终翻译为蛋白质，而rRNA, tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。
⑥gRNA，引导RNA，真核生物中参及RNA编辑的具有及mRNA互补序列的RNA。
2．DNA半保留和半不连续复制
答：①DNA 半保留复制是：DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶的作用生成两个新的DNA分子。 子代DNA分子 其中的一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。
②半不连续复制是由于DNA双螺旋的两股单链是反向平行，一条链的走向为5'→3',另一条链为3'→5',DNA的两条链都能作为模板以边解链边复制方式，同时合成两条新的互补链。但是，全部已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，所以在复制是，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制，称为前导链；另一条链的合成方向及复制叉前进方向相反，不能顺着解链方向连续复制，必需待模板链解开至足够长度，然后从5‘→3’生成引物并复制子链。延长过程中，形成冈崎片段，要等待下一段有足够长度的模板，再次生成引物而延长，然后连接起来，这条链称滞后链。因此就把前导链连续复制，随从链不连续复制的复制方式称为半不连续复制。
3．端粒酶的工作原理
答：原核生物的染色体是环状的，其5'最末端岗崎片段的RNA引物被降解后可借助另半圈DNA链向前延长来填补。但真核生物线性DNA在复制后，不能填补5'末端的空缺，从而会使5'末端序列因此而缩短。真核生物通过形成端粒结构来解决此问题，复制使端粒5'末端缩短，而端粒酶可外加重复单位到5'末端上，结果便是维持端粒肯定的长度。
端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以所含的RNA引物为模板来合成DNA端粒结构。端粒酶可结合到端粒的3'末端上，RNA引物的5'末端识别DNA的3'末端碱基并相互配对，以RNA链为模板使DNA链延长，合成一个重复单位（TTTAGGG）后 ，酶再向前移动一个单位。合成结束后，端粒的3'单链末端折回作为引物，合成其互补链。
4．原核DNA复制过程中遗传信息的保真机制
答：①DNA聚合酶IIIε亚基具有3'到5'核酸外切酶的活性，在聚合过程中其有校对作用。（DNA聚合酶III的困难亚基结构（由10种亚基组成）使其具有更高的忠实性, 协同性和持续性，如无校对功能，复制出错率仅为7×10-6，具有校对功能后降低至5×10-9。）
②DNA聚合酶I在DNA复制中起着，识别甲基化母链，切除, 修复错误复制的核苷对的作用。
③DNA聚合酶II也在复制中起修复复制错误的实力。
综上所述，所以DNA的复制有着高度的保真性。
5*．原核和真核复制，mRNA转录，蛋白翻译，基因表达调控的异同
答：⑴复制：
原核生物及真核生物DNA复制共同的特点：
①分为起始, 延长, 终止三个过程；
②必需有供应3’羟基末端的引物；
③亲代DNA分子为模板，四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)为底物，多种酶及蛋白质 ：DNA拓扑异构酶, DNA解链酶, 单链结合蛋白, 引物酶, DNA聚合酶, RNA酶以及DNA连接酶等;
④一般都为半保留复制, 半不连续复制。
原核生物及真核生物DNA复制不同的特点：
①真核生物为线性DNA,具有多个复制起始位点，形成多个复制叉，DNA聚合酶的移动速度较原核生物慢。原核生物一般为环形DNA，具有单一复制起始位点。
②真核生物DNA复制只发生在细胞周期的S期，一次复制开始后在完成前不再进行复制，原核生物多重复制同时进行。
③真核生物有多个复制子ＡＲＳ大小不一且并不同步。原核生物只有一个复制子Ｏｒｉ。
④真核生物有五种DNA聚合酶，须要Mg+。主要复制酶为DNA聚合酶δ（ε），引物由DNA聚合酶α合成。原核生物只有三种，主要复制酶为DNA聚合酶III。
⑤真核生物末端靠端粒酶（部分细胞）补齐，而原核生物以多联体的形式补齐。
⑥真核生物冈崎片段间的RNA引物由核酸外切酶MF1去除，而原核生物引物由DNA聚合酶I去除。
⑵ｍＲＮＡ转录：
原核生物及真核生物ｍＲＮＡ转录共同的特点：
①都分为分为起始, 延长, 终止三个过程；
②都有启动子, 终止子或终止信号, 调控序列；
③所需原料都有ＲＮＡ聚合酶, ＮＴＰ等。
原核生物及真核生物mRNA转录不同的特点：
① 真核生物转录起始,延长, 终止都须要因子的帮忙
② 原核的启动子为-10box和-35box，真核为TATAbox。
③ 真核生物要进行5′加帽 (转录早期进行30 nt) , 3′加尾 (前体mRNA加polyA) , 切除内含子 , 编辑和修饰。
④ 原核生物mRNA, tRNA, rRNA 都 由同一种RNA聚合酶转录而真核是三种不同的酶。
⑤ 原核生物转录终止是依靠终止子（发夹结构），真核生物是依靠转录信号（AAU, AAG）
⑶蛋白质翻译：
原核生物及真核生物蛋白质翻译的共同特点：
① 都分三步进行，即翻译的起始, 肽链的延长, 肽链的终止及释放
② 遗传密码相同
原核生物及真核生物蛋白质翻译不同的特点：
① 翻译起始核糖体识别序列原核是ＳＤ序列且有多个，真核是先通过5‘’Cap序列上的帽结合蛋白，找到mRNA，再通过Kozak序列找到翻译起始AUG进入P位。
② 原核是转录及翻译相耦联，故翻译也在细胞核内，而真核翻译在细胞核外。
③ 原核翻译起始tRNA为fMet-tRNAfMet ，真核为Met-tRNAMet。
④ 真核翻译有困难的后加工系统，如糖基化, 磷酸化-去磷酸化等，原核无。
⑷基因表达调控：
原核生物及真核生物基因表达调控相同的特点：
表达为多层次
原核生物及真核生物基因表达调控不同的特点：
① 原核是以操纵子进行转录的调控，真核是受单基因限制。
② 原核生物调控在2个水平（转录水平的调控, 翻译水平的调控），真核在五个水平（DNA水平的调控, 转录水平的调控, 转录后水平的调控, 翻译水平的调控, 翻译后水平的调控）进行基因表达调控。
③ 真核生物中有选择性剪接，原核没有
④ 原核的基因表达主要受环境等调控，真核是受激素等调控。
6．PCR及细胞内DNA复制的异同
相同点：原料都是四种脱氧核苷酸, 模板, 都须要引物, 都是单链DNA，都遵循碱基互补配对原则。
不同点：
PCR技术                                     DNA生物复制
环境   体外复制， 加热，90摄氏度左右      体内，温柔的环境
酶    主要是DNA聚合酶 ,                    DNA解旋酶，DNA聚合酶，
引物酶 DNA连接酶等各种酶
引物   须要人工合成的引物                  自己合成引物成分
步骤  变性--退火--延长                    解旋-起始-延长-结束
大小 一般只复制引物及以内的片段 整个基因组
起点 由引物确定 原核Ori, 真核ARS
7．Southern blot, Northern blot, Western blot三种分子生物学技术差异
答：
名称
检测对象
探针
检测原理
处理过程
用途
Southern
blot
DNA
标记单链核
酸
核酸复性中
碱基配对专
一性
琼脂糖电泳
后转膜
基因检测
（拷贝数）
Northern
blot
RNA
标记单链核
酸
核酸复性中
碱基配对专
一性
变性琼脂糖
电泳后转膜
基因表达的
检测（表达
量）
Western
blot
蛋白
抗体
抗原－抗体
特异性结合
SDS-PAGE
后转膜
基因表达产
物――蛋白
的检测
8．复制，转录，翻译，调控中的各种保守序列及其功能
⑴复制
Ori:原核生物复制起点
ARS: 真核生物复制起点
⑵转录
启动子：确定转录方向及模板链 , 转录效率
操纵子（原核）：将转录及翻译相耦联
终止子：终止转录
⑶翻译
SD序列：原核生物翻译起始，SD序列的顺序及位置对翻译都有影响。
Kozak序列：真核生物翻译起始
⑷调控
转录水平调控：
增加子：作用于启动子，提高转录活性
缄默子：作用于启动子，降低转录活性
9．乳糖操纵子和色氨酸操纵子(包括的衰减子)的工作原理
答：⑴乳糖操纵子
乳糖操纵子是个弱启动子，包括３个结构基因：Ｚ, Ｙ和Ａ，以及启动子, 限制子和阻遏子等。
乳糖操纵子负控诱导模式：无诱导物时，LacⅠ基因转录产生阻遏物单体，结合形成同源四体，Lac同源四体及操纵区（O区）DNA相结合，阻遏基因转录。基因不表达。当有诱导物时，诱导物使LacⅠ变成不能及O区相结合的非活化形式，RNA聚合酶就可以及Lac启动子区相结合，起始转录基因。mRNA被转录成三个蛋白质，即贝塔-半乳糖苷酶, 贝塔-半乳糖苷透过酶, 贝塔-半乳糖苷乙酰基转移酶。（（图解）乳糖操纵子是个弱启动子，在葡萄糖和乳糖都存在的状况下，大肠杆菌利用葡萄糖，是因为葡萄糖可降低cAMP浓度，阻碍其及CAP结合，而cAMP-CAP是激活Lac的重要组成部分，Lac启动子表达受阻，就没有贝塔-半乳糖苷酶活性。不能利用乳糖。所以说lac操纵子强的诱导作用既须要乳糖又需缺乏葡萄糖）
⑵色氨酸操纵子
色氨酸操纵子调控作用主要有三种方式:阻遏作用, 弱化作用以及终产物Trp 对合成酶的反馈抑制作用。
①阻遏作用:trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。在有高浓度Trp存在时,阻遏蛋白- 色氨酸复合物形成一个同源二聚体,并且及色氨酸操纵子紧密结合,因此可以阻挡转录。当Trp 水平低时,阻遏蛋白以一种非活性形式存在,不能结合DNA。在这样的条件下, trp操纵子被RNA聚合酶转录,同时Trp 生物合成途径被激活。
②弱化作用: trp操纵子转录终止的调控。在trp operon,前导区的衰减子有4段特别的序列，可形成不依靠ρ因子的转录终止信号（衰减子的工作机理：碱基序列(即衰减子)包括4个分别以1, 2, 3和4表示的片段,能以两种不同的方式进行碱基配对, 1 - 2和3 -4配对,或2 - 3配对, 3 - 4配对区正好位于终止密码子的识别区。前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,当培育基中Trp 浓度很低时,负载有Trp 的tR2NATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2 - 3配对,不形成3 - 4配对的终止结构,所以转录可接着进行。反之,核糖体可顺当通过两个相邻的 色氨酸 密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区这样使2 - 3不能配对, 3 - 4 区可以配对形成终止子结构, 转录停止。）
③终产物Trp 对合成酶的反馈抑制作用 由于基因表达必定消耗肯定的能源和前体物,相对于阻遏和弱化作用,反馈抑制作用更为经济和高效。
三．分析题
1．SDS-PAGE和双向电泳的原理
①SDS-PAGE是利用SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构, 同时SDS及蛋白定量结合, 消退蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依靠分子量 (分子小跑得快) .加上不连续电泳，即 上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线, 下层为分别胶; 可获得更高的辨别率.再用考马斯亮蓝进行染色.即可进行蛋白分子量的测定, 蛋白浓度的测定, 蛋白的鉴定。
②双向电泳是蛋白质组学中对蛋白质组进行探讨的主要分别方法，同时能分别成百上千种蛋白质。蛋白质在第一向依据电荷的不同（等电聚焦），第二向依据分子量的不同进行分别（SDS-PAGE）。分别后对蛋白质进行染色，依据实际分析状况，分别进行考马斯亮兰染色, 银染或荧光染色。
2．顺式作用元件工作的原理
答：顺式作用元件，包括启动子, 增加子, 调控序列和可诱导元件。
要及反式作用因子作用，才能促进基因表达，而反式作用因子在DNA水平和转录水平上作用，且具有组织特异性。
3．DNA序列及蛋白功能（表型）非线形关系
答：①基因具有强大的容错机制
②密码子的简并性，即使DNA错配发生在编码区也不会影响蛋白的表达。
③ 真核生物存在不表达蛋白的内含子
④ 基因间隔区, 非编码区等变异，不引起蛋白的变化。
⑤ 变异发生在蛋白质的非功能区，不影响蛋白质的功能。
4．PCR的原理，包括它的特异性
答：以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对及半保留复制原理，合成一条新的及模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延长三过程，就可获得更多的“半保留复制链”。 关于特异性是①引物设计的特异性，使引物能和模版上的特定片段配对，在最优条件下特异扩增。②退火温度的不合适，也会出现非特异条带（假阳性）。
5．Western blot的原理，包括二抗工作的原理
答：利用抗原抗体特异性结合，再用二抗作为探针去检测蛋白。即先用SDS-PAGE得到蛋白1，通过转膜，再用蛋白1的Ab1（一抗）及之结合，再用带着HRP的Ab2（二抗）去识别一抗。再显色检测结果。
6．DNA变性中的增色效应及OD值测DNA含量的关系
由于DNA变性引起的紫外光260nm汲取的增加称增色效应, DNA变性后，双螺旋结构解体，两条链分开，其碱基就能够更充分的汲取260nm处的紫外光。因此可将DNA变性后，测定DNA的在260nm时的OD值的高低来得到DNA含量，DNA含量越高，OD值越大。

7．衰减子工作的必要条件
衰减作用发生的必要条件是：①翻译产生前导多肽；②转录和翻译偶联。这样，但RNA聚合酶转录前导序列的同时核糖体就紧接着结合到新生的mRNA上翻译前导肽。mRNA的前导序列包括两个相像的反向重复序列。序列2及序列1和3互补，这样序列1和2, 2和3, 3和4都能通过碱基配对形成径环结构。由序列3和4配对形成的径环结构及操纵子的终止子基本相同。和终止子一样，在其径的一侧具有7个连续的U形成的尾巴。当形成这种衰减子结构时，它就能够像终止子一样使转录终止。

反式作用因子结构域的模式
DNA结合域：⑴锌指结构
⑵螺旋-转角-螺旋（NTH）
⑶亮氨酸拉链
⑷螺旋-环-螺旋（NLH）
⑸碱性α螺旋
转录活化结构域：⑴酸性α-螺旋结构域
⑵富含谷氨酰胺结构域
⑶富含脯氨酸结构域
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