1、选修一课堂默写（1）
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实验1 大肠杆菌的培养和分离
1．培养基的配制
（1） LB 培养基是通用的细菌培养基，其中包含水、 NaCl 、 蛋白胨 和 酵母提取液 （如果配制的是固体培养基，还需要加入 琼脂 ）。
（2）培养细菌的培养基中加入一定量NaCl的作用是 维持渗透压 。
（3）在制备培养基时，还需调节培养基的pH，细菌通常喜欢 中性偏碱性 的环境，调节pH应该在培养基灭菌之 前 （填“前”或“后”）。
2、4）培养基配置完成后，需转移分装到三角瓶、试管中，为了避免发生 污染 ，三角瓶口、试管口不能沾有培养基，因此，分装时必须用 三角漏斗（玻璃漏斗）。分装完成后，三角瓶口和试管口需要加棉塞，制作棉塞所需的棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉 易吸水，吸水后容易引起污染 。如果有条件，可以用__ 封口膜（橡胶塞、塑料盖）代替棉塞。
（4）常见的灭菌方法还有 高压蒸汽 灭菌法和 灼烧 灭菌法等三角瓶、培养皿和试管等器皿的灭菌要在121℃（ 1kg/cm2 压力）下灭菌15 分钟，这种灭菌方法称为 高压蒸汽 灭菌法。
（5）制备培养细菌用的空白试管斜面：LB液体培养基配好后，加入 琼脂并加热使之 融
3、化 ，在未凝固时，通过三角漏斗（玻璃漏斗） 加入试管（15mmX150mm）中，每支试管 2 ml。试管口加 棉塞 ，并将试管捆在一起，上端加盖一张 牛皮纸（报纸） 纸，灭菌后将试管 斜靠在平放的铅笔上 ， 冷却后，固体培养基即成为斜面。
2．大肠杆菌的扩大培养
将 接种环在酒精灯火焰上烧红后伸入保存有大肠杆菌的试管斜面，待其 冷却后再蘸取大肠杆菌，将其放入三角瓶的液体培养基中，然后将三角瓶用封口膜密封，放到37℃、每分钟200转的 摇床 上 振荡 12小时。
3．大肠杆菌的分离
（1） 单菌落 的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是筛选高表达量菌株的最简便方法之一。分离细菌的方法
4、主要有 划线 分离法和 涂布分离法。前者通常使用的工具是 接种环 ，后者通常使用的工具是 玻璃刮刀。其中操作方法较简单的是 划线 分离法，较容易得到单菌落的是 涂布 分离法。如果要统计活细菌的数目，宜采用 涂布 分离法。
（2）划线分离法：将 接种环 烧红并冷却后蘸取大肠杆菌菌液，然后在培养皿的 固体 培养基上连续划线。完成后盖上盖子，然后将培养皿 倒置 ，在37℃的 恒温培养箱 中培养12～24小时。由于在划线过程中 接种环 上的菌液逐渐 稀释，因此划线最后部分细菌间的距离逐渐 加大 。经培养后可看到在划线的末端出现不连续的 单菌落 ，这表明细菌已被分离。
（3）涂布分离法：
5、先将大肠杆菌菌液 稀释 ，然后取 0.1 ml稀释度不同的菌液，加到培养皿的 固体 培养基上。再将保存在 70% 酒精中的 玻璃刮刀 放在酒精灯火焰上，待玻璃刮刀上的火焰熄灭后，用其将培养皿中的菌液涂布在培养基平面上。完成后盖上盖子，然后将培养皿 倒置 ，在37℃的恒温培养箱 中培养12～24小时，最后可得到相互分开的 单菌落，这表明细菌已被分离。在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，通常以每个培养皿中有 20 个以内的单菌落 最为适宜。
4．大肠杆菌的保存
在 无菌 条件下，将大肠杆菌的单菌落用 接种环 取出，再用划线法接种在试管中的 斜面培养基 上，37℃培养24小时后，置于
6、4℃的 冰箱 中保存。
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
1．尿素又称脲 ，是 蛋白质 降解的产物。土壤中有一些细菌含有 脲酶 ，它们可以将尿素降解为 氨 ，从而为其生长提供 氮源 。在脲酶作用下，尿素分解的化学方程式是： 书25页
2．分离以尿素为氮源的微生物所用的培养基中含有水、NaCl、K2HPO4、 尿素 、 葡萄糖 、琼脂糖和酚红等，其中酚红作为 指示剂，琼脂糖作为 凝固剂，选用琼脂糖而不选用琼脂的原因是琼脂中含有一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的微生物的筛选。尿素培养基灭菌时，为防止尿素 分解 ，可将尿素溶液通过 G6玻璃砂漏斗 过滤
7、使其无菌。该设备使用前需经过 高压蒸汽灭菌，使用后需用1mol/L的 盐酸 浸泡，并抽滤去酸，再用 蒸馏水 清洗至洗出液呈中性，干燥后保存。培养基的其余成分配制好后用 高压蒸汽 灭菌法灭菌，待冷却至60 ℃时，加入无菌的尿素溶液，混合均匀后待用。同时配置好LB 固体培养基，灭菌待用。
3．制备土壤细菌悬液：在 无菌条件下，将1g土样加入有 99 ml无菌水的三角瓶中， 振荡10min，即成10-2土壤稀释液。取上述土壤稀释液0.5ml加入有4.5ml 无菌水 的试管中，震荡制成稀释度 10-3为土壤稀释液。依次法制备10-4和10-5土壤稀释液。取样时，尽量只取 悬液 。
4.
8、涂布：取稀释度10-4和10-5土壤稀释液各0.1ml，分别加到有LB 培养基和 尿素培养基的培养皿中，再将保存在 70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上的 火焰熄灭 ，在 酒精灯 旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
5.培养和观察：涂布后，将培养皿 倒置 ，在37℃的 恒温培养箱 中培养24～48小时。最终在尿素培养基上出现的菌落数要少于 （填“多于”、“等于”或“少于”）LB培养基，而且在尿素培养基上的菌落周围会出现 红 色环带。这是因为尿素培养基中的 氮源 只有尿素，含有 脲酶 的细菌才能利用尿素存活生长。它们将培养基中的尿素降解为 氨 ，使 酚红 变为 红 色。
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