大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab).doc

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
(Jin Quan-Wen Lab at XMU)

一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：
第一天：
1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中，可以准备两管。37°C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。
第二天：
1． 取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 0,03-0,05。 37°C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.4时，停止培养。
2． 将菌液在冰上预冷30分钟。同时，开启离心机，预冷至4°C。
3． 随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中，4°C，4000rpm离心15分钟。
4． 弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。4°C，4000rpm离心15分钟。
5． 弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。4°C，4000rpm，离心15分钟。
6． 弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。 4°C, 4000rpm, 离心10min。
7． 小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml 10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。
8． 将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70°C冰箱中保存。
9． 检测转化效率：取100ml新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10ml (1%)和100ml (10%)涂板，估测转化效率。

* Optimal efficiency is ca. 1X108 cfu/µg DNA for general cloning.
** For library transformation, efficiency with ca. 1X109 cfu/µg DNA is required.

感受态细胞制备简要流程：
收集细胞à冰水冲洗细胞2次à10%甘油冲洗细胞1次à重悬细胞在10%甘油à分装

二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒文库]：
1．从-80°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。
3．将解冻的感受态细胞按照40～100ul/管转移至预冷的1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置。
4．取1-2 µl 纯化的质粒或克隆连接产物于1.5ml的离心管中，冰上放置10min。[加入的DNA体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！]
5．打开电转仪[Bio-Rad Gene Pulser System]，调至Manual，调节参数设置为25 µF, 200 OHMs, 电压为2.0 kV [这些参数设置可以根据经验略作调整]。
6．将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。
7．将电击杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X 500ml的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
8．37°C，220－250rpm复苏1小时。
9．离心，涂板，置于37°C，过夜培养，次日查看转化结果。

三、电击杯的清洗和保存：
1. 用清水将用过的电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入75%酒精冲洗。
2．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10次以上。
3．加入无水乙醇1-2ml于电击杯中，浸泡5分钟。
4．弃去无水乙醇，将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。
5．将清洗并干燥好的电击杯加上盖子，存放备用。

几种可以选用的细菌培养基：

200ml
500ml
1000ml
LB
1 g yeast extract
2 g tryptone (or peptone)
2 g NaCl
2.5 g yeast extract
5 g tryptone (or peptone)
5 g NaCl
5 g yeast extract
10 g tryptone (or peptone)
10 g NaCl
2´TY
3.2 g Tryptone
2 g Yeast Extract
1 g NaCl
[用5 N NaOH调pH值至7.0]
8 g Tryptone
5 g Yeast Extract
2.5 g NaCl
[用5 N NaOH调pH值至7.0]
16 g Tryptone
10 g Yeast Extract
5 g NaCl
[用5 N NaOH调pH值至7.0]
SOC
4 g Tryptone
1 g Yeast Extract
0.1 g NaCl
2 ml KCl (250 mmol/L)
1 ml MgCl2 (2 mol/L)
4 ml Glucose (1 mol/L)
10 g Tryptone
2.5 g Yeast Extract
0.25 g NaCl
5 ml KCl (250 mmol/L)
2.5 ml MgCl2 (2 mol/L)
10 ml Glucose (1 mol/L)
20 g Tryptone
5 g Yeast Extract
0.5 g NaCl
10 ml KCl (250 mmol/L)
5 ml MgCl2 (2 mol/L)
20 ml Glucose (1 mol/L)
Note: 1. 溶液使用前，加入灭菌的MgCl2;
2. SOC培养基除含有20 mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或以下，加20 ml除菌的1 mol/L葡萄糖溶液（1 mol/L葡萄糖溶液的配制方法是：用90 ml去离子水溶解18 g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至100 ml，用0.22 um滤器过滤除菌）