微生物工程考点整理.doc

微生物工程考点整理
名词解释：名词解释5道，每道4分，每道里面又细分出两个相对应的名词。
1、微生物工程：旧称发酵工程或微生物发酵工程，利用微生物的特定性状和功能，通过现代工程技术生产有用物质或把微生物直接应用于工业化生产的一种生物技术体系。
2、富集培养（增殖培养） ：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，从而有效地分离到所需要的菌株。这种方法又称为施加选择性压力分离法。
3、微生物原生质体融合：将双亲株的微生物细胞分别通过酶脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的溶液中混合，并加入物理的（如电融合）、化学的（如聚乙二醇）或生物的（如仙台病毒）助融条件，使双亲菌株的原生质体发生凝聚，这样通过细胞质的融合，细胞核的融合，尔后基因间的交换、重组，进而可在适宜的条件下再生出细胞壁，获得重组子的过程。
4、菌种活化:就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养,逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物,即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。
5、种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
6、孢子培养基：供菌种繁殖孢子常采用固体培养基。对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速，产生数量多且优质的孢子，并且不会引起菌种变异。
7、种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖。对于最后一级种子培养基的成分应该较接近发酵培养基，以便种子接入发酵培养基后，能迅速适应发酵环境，快速生长。
8、发酵培养基：发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。既要有利于生长繁殖，防止菌体衰老，又要有利于产物的大量合成。
9、生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
10、前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在生物合成过程中结合到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
11、产物促进剂：是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
12、临界溶氧浓度：指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。
13、临界稀释率：连续培养过程中菌体发生洗出时的稀释率，以DC表示
最适稀释率：指细胞或产物的生产能力达最大时的稀释率。
14、二次生长现象：凡是快速利用的基质都可阻止对其他基质的利用，只有当快速利用的基质被消耗之后，才开始利用第二种基质，而在利用其它基质时，有一生长停滞期，这是利用第二种基质的酶合成的时期。这种现象被称为二次生长。
15、能荷：能荷是指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。
能荷调节:也称腺苷酸调节，系指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。
16、同工酶：又称同功酶。是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
17、组成酶：又称固有酶或结构酶，微生物不论生长在什么培养基中，其有些酶总是适量地存在，它们是不依赖于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。
诱导酶：又称适应性酶，是依赖于某种底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。诱导酶合成的基因以隐性状态存在于染色体中。
18、代谢控制发酵：用人工诱变的方法有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵。
19、代谢工程:又称途径工程，系指利用基因工程技术、定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。
20、倍增时间：细胞群体数量增加一倍的时间为倍增时间，而单个细胞分裂所需的时间为代时。细胞群体平均代时为倍增时间。
21、微生物转化：是通过微生物代谢导致有机物或无机化合物的分子结构发生某种改变、生成新化合物的过程。
22、好氧活性污泥：是有多种多样的好氧微生物和兼性厌氧微生物（兼有少量的厌氧微生物）与其上吸附的无机的和有机的固体杂质组成。
23、活性污泥法：污水通气一段时间后，形成一种由大量微生物群体构成的易于沉淀的絮凝体，经过一系列的处理过程把杂质排除的污水生理处理技术。
24、生物膜法：以生长在固体（称为载体或填料）表面上的生物薄膜进行净化处理的生物处理法。填空：共20空，每空一分。
1.微生物工程的发展简史：传统的微生物发酵技术－天然发酵（特点：非纯种发酵 ），第一代微生物发酵技术－纯培养技术的建立，第二代微生物发酵技术－深层培养技术，第三代微生物发酵技术－微生物工程（特点:产品来源多样化）。其中，纯培养技术为发酵工业的第1个转折期，通气搅拌技术为发酵技术进步的第2个转折期，代谢控制发酵技术为发酵技术发展的第3个转折期，发酵原料的转变为第4个转折期，现代生物技术即微生物工程可称为第5个转折期。
2.微生物工程工业生产水平的三个决定要素：生产菌种的性能，发酵及提纯工艺条件和生产设备。
3.能产生抗生素等次级代谢产物的菌种有放线菌，真菌以及产芽孢的一些细菌。 这些微生物共同的特点是代谢途径比较清楚、代谢途径比较简单。
4.产生α-淀粉酶的菌种：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
5.谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属（如谷氨酸棒杆菌），短杆菌属（如黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌）、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌，产生其他氨基酸的生产菌有大肠杆菌，枯草杆菌。
6.微生物适宜生活的土壤深度是525CM。采土样季节最为理想的是秋季。采样时给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。选择菌种遵循的原则：材料的来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
7.富集菌种的方法有物理法：加热和膜过滤法；培养法：液体，固体培养。
8.培养基按纯度分为合成培养基和天然培养基，按状态分为固体培养基，半固体培养基和液体培养基。按用途分为孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。培养基一般的营养成分：碳源，氮源（有机氮和无机氮），生长因子，（嘧啶，嘌呤，维生素等），产物促进剂和水。
9.纯种分离的方法有平板划线分离法、稀释涂布法、混菌法等。
10常用的菌种保藏方法：斜面保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡法、沙土管干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、悬液保藏法、低温保藏法等。
11.比较大的菌种保藏机构有美国典型菌种保藏中心（ATCC）、日本大阪发酵研究所（IFO），中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）等。
12.育种方法：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程、单倍体育种、多倍体育种。微生物育种主要涉及前五种。
13.诱变时要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。根据细胞生理状态或诱变剂的性质和诱变谱来选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，有几大类诱变剂。物理诱变剂 ：紫外线、快中子、X射线、β射线、γ射线、激光。化学诱变剂：烷化剂（如强致癌的亚硝基胍），碱基类似物，移码诱变剂（如丫啶类化合物），脱氨基诱变剂（如亚硝酸）。生物诱变剂 ：噬菌体，转座子。
14.原生质体融合的一般程序：原生质体的制备→原生质体的融合和再生→原生质体的检出（筛选）。对微生物进行细胞融合时，革兰氏阳性菌和放线菌用溶菌酶去除细胞壁，革兰氏阴性菌用乙二胺四乙酸（EDTA）+溶菌酶去除细胞壁，真菌多用纤维素酶、几丁质酶和糖苷酶等溶壁；酵母菌用蜗牛酶溶壁。
15.代谢可分为分解代谢和合成代谢。分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。合成代谢是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，在这个过程中要消耗能量，合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物或环境中的小分子营养物质。
微生物自我调节的部位：细胞膜、酶量和酶活性、限制基质的有形接近。酶促调节分两类：酶活性调节和酶合成的调节。其中，酶活性调节包括两个方面，即酶的激活作用和酶的抑制作用；按方式机制有 变构调节 和 修饰调节 。
而酶量调节的方式包括 诱导 和 阻遏 两种类型。能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂，诱导剂可以是诱导酶的底物，也可以是底物的结构类似物。在阻遏调节里，如果代谢产物是某种合成途径的终产物，这种阻遏称为末端产物阻遏；如果代谢产物是某种化合物分解的中间产物，这种阻遏称为分解代谢产物阻遏（是在研究混合碳源对微生物生长的影响时发现的，最初发现葡萄糖效应，后来发现所有可以利用或代谢的能源，都能阻遏异化另一种被缓慢利用能源所需酶的形成，故被称为分解代谢产物阻遏，出现二次生长现象，有一生长停滞期，是利用第二种糖的酶合成的时期）。
16.常用的控制微生物发酵途径的方法有：控制发酵条件，改变细胞膜透性，微生物遗传特性等。
17. 真核生物基因表达调控的五个水平：DNA水平调节，转录水平调节，转录后加工调节，翻译水平调节和翻译后加工的调节。
18.影响发酵热热量的类型有生物合成热，搅拌热，蒸发热，显热，辐射热；
19.根据产物形成与基质消耗关系，发酵类型分为生长产物合成偶联型，生长产物合成半偶联型，生长与产物的非偶联型。
20.发酵物料衡算：S（底物）─→ X（菌体） ＋ P（产物）+维持。
21.发酵条件的控制可分为:各种发酵条件对微生物代谢的影响、使用诱导物、添加生物合成的前体、培养基成分和浓度的控制四种方式。
22.生产氨基酸的方法有抽提法，酶法，发酵法，合成法。
23.抗生素的分类方法很多，按生物来源分类青霉素属于 真菌产生的 抗生素，按作用对象分类属于 抗G+的 抗生素，按化学结构分类属于 β-内酰胺类 抗生素，按照抗生素的作用机制分类属于 抑制细胞壁合成的 抗生素。一个青霉素效价单位是指能在 50ml肉汤 培养基中，完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。
24.好氧生物膜法构筑物有普通滤池、高负荷生物滤池、塔式生物滤池，还有生物转盘、接触氧化法(即浸没滤池法)等。
25.温度对发酵的影响主要表现：对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方向等方面。
26.选择最适PH的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量。
27.影响供氧的因素：搅拌、空气流量、培养液的性质、微生物生长的影响、消沬剂的影响和离子强度的影响。
28.二氧化碳浓度的控制：1:加大通气量和增加搅拌速率；2:补料（在青霉素发酵中，补糖可增加排气中CO2的浓度，并降低培养液的pH值）。
29.改变菌种的代谢调节过程，提高代谢产物的积累可以通过两种方式，一种就是通过各种育种方法，选育基因突变株，从根本上改变微生物的代谢；另一种是控制微生物的各种培养条件，影响其代谢过程。
30.甾体转化工艺一般分为两个阶段，即生长阶段和转化阶段。

判断10道，每道一分，共10分。试题略。

问答题7道，共50分。
1.发酵培养基的设计的步骤
答：① 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分。
② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分。
③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。 如多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。

2.微生物菌种来源的途径
答：①根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；
②从大自然中分离筛选新的微生物菌种，如水、土、空气、动植物体；
③从发酵制品中分离目的菌株，如酸奶。

3.微生物菌种选育方法

4.产蛋白酶菌种的分离和筛选。
答：①定方案：先查阅资料，了解产蛋白酶菌种的生长培养特性。
②采样：在豆制品、蛋类、奶制品、肉制品和动物羽毛的堆放、生产及加工地点附近取样，如食堂、豆浆坊等。取5-25CM深的土壤或浅层水样，采样时给塑料袋或瓶编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
③标本材料的预处理：一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样 品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管 斜面，随身带走。
④富集培养（增殖培养）：富集用肉汤培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1% ，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20min。加入牛奶或酪蛋白显示菌体生长后产生的水解圈。若要筛选产碱性、酸性、高温、低温等条件的蛋白酶生产菌种，则把培养条件相应调整，如加热、降温、加酸碱调pH等，对丝状菌还可采取过滤方式。
⑤划线分离或稀释涂布平板进行分离纯化。
⑥菌种初筛和菌种复筛：初筛时，从中挑选出多个水解圈直径与菌落直径的比值较大的菌落。复筛时，将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到几个最优的菌株，再用琼脂平板重新测定。
⑦发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
⑧产物鉴别：测定蛋白酶的活性，探究其影响因素及最佳作用条件。
⑨菌株鉴定：DNA测序，以及参考《伯杰氏细菌鉴定手册》 。

5. 微生物菌种保藏的基本原则是什么？常用的有哪些方法？
由于DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代谢不活泼的状态如休眠态的孢子、芽孢和处于特殊环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）的菌体。一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。常用的菌种保藏方法：斜面保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡法、沙土管干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、悬液保藏法、低温保藏法等。

6.种子的扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的是为了接种量的需要，菌种的驯化和缩短发酵时间，保证生产水平。
种子的要求：生理状况稳定，个体与群体的差异较小；总量及浓度能满足要求；活力强，生长快；无杂菌污染。
种子制备的过程包括实验室阶段和生产车间阶段，总体一般经过斜面菌种→ 一级种子培养→ 二级种子培养→ 发酵。
其中涉及的重要因素：种子类别（菌丝体比孢子要有利），培养基（实验室阶段原料精细；而种子罐的培养基接近于发酵培养基是为了节省成本和驯化菌种），起始接种物的传代应使菌种的传代次数尽可能的少，在生产车间阶段要注意确定接种量、种龄、发酵级数。

7.工业发酵过程染菌的原因及检测方法。
染菌的原因途径：种子带菌； 空气带菌； 设备的渗漏或“死角”； 培养基灭菌不彻底； 噬菌体染菌；操作不熟练，配料违反工艺规程等。
检测方法：①显微镜检查法（镜检法）
②肉汤培养法（0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4％的1％酚红溶液(pH7.2)的葡萄糖酚红肉汤于37℃和27℃进行培养检查培养基和无菌空气是否带菌）
③平板划线法或斜面培养法检查法
④发酵过程的异常现象观察法 （溶解氧，排出气中的CO2含量，pH值变化，菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化，耗糖快慢，发酵过程中泡沫的异常增多，发酵液的颜色、气味等性质异常，代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长等方面来检查发酵是否染菌。

8.分支生物合成途径的调节：
1、同工酶调节：在分支途径中的第一个酶有几种结构不同的一组同工酶，每一种代谢终产物只对一种同工酶具有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才能完全阻止反应的进行。例如大肠杆菌天门冬氨酸族氨基酸的合成。有三个天门冬氨酸激酶催化途径的第一个反应，分别受赖氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸的调节。
2、协同反馈调节：在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用。若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。例如，在多粘芽孢杆菌合成赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的途径中终点产物苏氨酸和赖氨酸协同抑制天门冬氨酸激酶。
3、累加反馈调节：在分支代谢途径中，任何一种末端产物过量时都能对共同途径中的第一个酶起抑制作用，而且各种末端产物的抑制作用互不干扰。当各种末端产物同时过量时，它们的抑制作用是累加的。大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶的调节过程中发现的，该酶受6个最终产物的积累反馈抑制。6个最终产物同时存在时，酶活力完全被抑制。
4、顺序反馈调节：分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。因此，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶起到抑制作用。枯草芽孢杆菌合成芳香族氨基酸的代谢途径就采取这种方式进行调节。
此外，还有增效反馈调节、激活和抑制联合调节和酶的共价修饰等。

9. pH值对发酵的影响
1）影响微生物的生长繁殖。
2）影响微生物的形态。
3）pH影响代谢产物的形成的数量和方向 ：pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
4）影响产物的稳定性
5）pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响 10、发酵过程中起泡沫有什么危害？如何消泡？
一、起泡的危害
1、降低生产能力：在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量
2、引起原料浪费：如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。
3、影响菌的呼吸：如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。
4、引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。
有利之处：气体分散、增加气液接触面积
二、 泡沬的控制：
1、调整培养基配方2、消泡剂消泡 3、机械消泡 4、操作上的适当调节（不常用）。

11.青霉素的发酵工艺及提炼工艺。

发酵过程：

提取分离纯化：
1、 预处理：发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白。
2、 过滤：鼓式真空过滤机或板框式过滤机过滤。
3、 溶剂萃取：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。萃取剂：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：2-3次。整个过程在低温下进行（10度以下），萃取罐用冷冻盐水冷却。
4、脱色：萃取液中添加活性炭，除去色素、热原。过滤除去活性炭。
5、共沸蒸馏结晶：钾盐溶于0.5 M KOH,调pH至中性，加2.5倍体积丁醇，16-26℃，真空（0.67-1.3KPa）下蒸馏。
水和丁醇形成共沸物而蒸出。钾盐结晶析出。
6、结晶经过过滤、洗涤、干燥（60℃真空16h），磨粉，包装，得到青霉钾盐素产品。

12.活性污泥法处理污水、脱氮、脱磷及A2/O 工艺
1）曝气池：微生物降解有机物的反应场所
2）二沉池：泥水分离
3）污泥回流：确保曝气池内生物量稳定
4）曝气：为微生物提供溶解氧，同时起到搅拌混合的作用。
5）剩余污泥：排出，并加以净化。

活性污泥法处理污水的流程示意图

脱氮原理
缺氧反硝化
细菌：反硝化细菌（兼性厌氧菌）
反应：NO3-—N反硝化还原为N2，溢出水面释放到大气
碳源：原水中BOD
硝酸盐来源：回流出水中的硝化产物
好氧脱碳硝化
脱碳——氧化去除COD
脱碳菌——好氧有机物呼吸的细菌，以有机物为碳源
硝化菌——好氧氨盐呼吸的细菌，以碳酸盐为碳源
（NH4+→NO2-→NO3-)

提问：为什么先脱碳、后脱氮？答：硝化菌的碳源是脱碳菌的代谢产物；有机碳源丰富时，脱碳菌世代周期短生长迅速 ，硝化菌氧利用不足，生长缓慢；
硝化脱氮时有时需要补碱（Na2CO3或NaOH)? 答：硝化作用消耗碱（NH4+、CO32-），水pH下降；补充碳源、升高pH。
硝化菌世代周期长，容易从活性污泥系统中被洗掉，如何解决？ 答：挂生物膜或投加悬浮填料，定期投菌。
为什么要进行内回流？答：好氧池的硝化作用将还原性N氧化为NO3-，通过回流控制返回至缺氧池，缺氧池中的厌氧菌在缺氧条件下进行反硝化作用将NO3-还原为分子态氮（N2），完成C、N、O在生态中的循环，实现污水无害化处理。

好氧时：大量繁殖（消耗好氧状态能源——聚β-羟基丁二酸（PHB）），
逆浓度梯度过量吸磷（贮备厌氧状态能源——多聚磷酸盐颗粒(即异染颗粒) ）；
厌氧时：正相反——不繁殖，释放磷酸盐于体外（产生能量供其储备消耗好氧状态能源——PHB）。

提问：什么是活性污泥膨胀？
正常的活性污泥颗粒体积膨胀，继而分裂为沉降性很差的小颗粒污泥，引起二沉池池面飘泥严重，出水水质急剧变差的现象。本质—污泥密度变小或黏附能力下降。分非丝状菌污泥膨胀与丝状菌污泥膨胀两类。
发生后如何处理？
A．投加次氯酸钠（10~20mg/l内）、H2O2（100~200mg/l内），有选择的控制丝状微生物的过渡生长。
B．投加混凝剂FeSO4和FeCl3、干污泥或浓缩消化污泥，增加絮体密度、强度，使已膨胀的污泥恢复正常。
C.强化补氮（C:N＝100：20～30）
D.替换污泥，最直接的方法。