生物化学实验知识点整理.doc

生物化学实验知识点整理
实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定
1.还原糖测定的原理
3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm处测定光的吸收增加量，得出该溶液的浓度，从而计算得到还原糖的含量
2.总糖测定原理
多糖为非还原糖，可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖，在利用还原糖的性质进行测定，这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量
3.电子天平使用
4.冷凝回流的作用：
使HCl冷凝回流至锥形瓶中，防止HCl挥发，从而降低HCl的浓度。
5.多糖水解方法：
加酸进行水解
6.怎样检验淀粉都已经水解：
加入1-2滴碘液，如果立即变蓝则说明没有完全水解，反之，则说明已经完全水解。
7.各支试管中溶液的浓度计算
8.NaOH用量：
9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同
10.分光光度计的原理：在通常情况下，原子处于基态，当通过基态原子的某辐射线所具有的能量（或频率）恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量（或频率）时，该基态原子就会从入射辐射中吸收能量，产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的，所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式。
实验证明，在一定浓度范围内，物质的吸光度A与吸光样品的浓度c及厚度L的乘积成正比，这就是光的吸收定律，也称为郎伯比尔定律
分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理，来测定浓度
11.为什么要水解多糖才能用DNS
因为DNS只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物，不能与没有还原性的多糖反应。
12.为什么要乘以0.9
因为淀粉的水解方程式为，只有用还原糖的含量乘以0.9才能得到多糖的含量。
13.为什么要中和后再测？
因为DNS要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应
实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
1.纸色谱分离氨基酸分离原理
由于各氨基酸在固定相（水）和流动相（有机溶剂）中的分配系数不同，从而移动速度不同，经过一段时间后，不同的氨基酸将存在于不同的部位，达到分离的目的。
2.天然氨基酸为L型
3.酸式水解的优点是：是保持氨基酸的旋光性不变，原来是L型，水解后还是L型，由于甘氨酸所有的R基团是氢原子，所以它不是L型
5.酵母粉水解后绝对不含有色氨酸
6.根据分离原理不同分离色谱可分为：有吸附色谱、离子交换色谱、分配色谱等
7.不同物质的Rf值不同，同种物质不同条件的Rf值不同
吹分时不能吹的过热和过干，与滤纸结合太紧密。流动相带走不是很容易。容易出现拖尾
8.喷完茚三酮后不能直接放入烘箱，先自然晾干再放入烘箱内，茚三酮乙醇高温易着火，烘箱的金属条过热也会显色。会出现拖尾或斑点状，样品显色后成条状，；酵母分解后不知有5个斑点，会有很多种，两种之间可能还有其它的氨基酸，
9.茚三酮的反应方程式
10.考马斯亮蓝测定蛋白质浓度 :范德瓦尔键通过分子间静电吸引力结合
11.考马斯亮蓝分为G-250（反应速度快，不易洗脱，用定量测定）、R-250反应速度慢，易洗脱，通常用于定性测定
12.考G-250与蛋白质结合后稳定时间为1h左右
13.蛋白质的盐析反应
蛋白质中加入某些饱和盐，蛋白质溶液中浓度下降，蛋白质析出
14.蛋清：NaCl溶液=1：9 10%卵清蛋白
实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳、实验六 维生素C的定量测定
1.醋酸纤维薄膜电泳的原理、影响迁移的因素
血清中各种蛋白质离子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动。由于各种蛋白质的等电点不同，从而在同一pH环境中所带电荷量有所不同，同时分子大小形状各有差异，所以在统一电场中泳动速度不同。一般来说，所带的电荷多且颗粒小的，泳动速度快，反之则慢。
2.影响电泳的因素：
（1）粒子本身 （电荷量、粒子大小、形状）
（2）黏度
（3）电场
（4）电渗
（5）支持物的筛口
3.醋酸纤维薄膜的优点
具有均一的泡沫样结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。
4.pH8.6中带负电，往阳极移动
5.五条带的顺序：血清蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白
6.层析时，粗糙面朝上，电泳时粗糙面朝下，记号做在光泽面
7.实验成败的关键P43-P45
8测定VC的原理：还原型抗坏血酸能还原2，6-二氯酚靛酚染料，本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2，6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即变成无色。一旦溶液中的维生素C全部被氧化，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。
9.1%草酸有何作用
（1）提供一个显色环境
（2）保护维生素C
（3）作空白对照
实验七 蛋白质总氮含量的测定、实验八 正交法测定几种因素对酶活性的影响
1.凯氏定氮法的原理：
含氮有机化合物在浓硫酸中消化生成硫酸铵，再在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液使硫酸铵分解放出氨气。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准酸溶液进行滴定，准确测定按量，从而计算出含氮量。
2.用此方法通常会高于实际含量？
3.H3BO3指示剂在pH<5.4时为紫红，pH>5.4时为绿色
4.CuSO4催化反应
K2SO4与NaSO4提高反应沸点
5.凯氏定氮法的优点：可以测定固液试样
6.怎样检测蒸馏器已洗净（P53）
7.为什么小漏斗内要作保留一点30%NaOH
NaOH加进后会立即反应放出氨气，主要作水封
8.正交法实验原理
利用正交表来安排多因素实验的方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分试验的结果的分析，了解全部实验的情况，找出最优组合。
特点：
用部分试验代替全部试验，通过部分试验结果分析，了解全部实验的情况