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荧光和化学发光免疫分析方法

免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。

一、免疫

免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。

特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。

1、抗原

1.1抗原的定义

抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。

抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。

1.2抗原的分类

完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。

半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，

1.3抗原的性质

决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。

抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。

因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。

2、抗体

2.1抗体的定义

抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。

2.2抗体的结构

抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。

人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

3、抗原抗体的结合

体外抗原抗体反应又称血清学反应

第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，需时短，几秒至几分钟，无可见现象出现。

第二阶段，可见反应阶段，表现为凝集、沉淀、细胞溶解等，时间较长，历时数分钟、数小时以致数天

4、抗原抗体结合的特点

（1）抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发生反应。抗原与抗体两者为非共价键结合，为可逆反应 

2）抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应；以沉淀反应为例，分子比例合适，沉淀物产生既快又多，体积大。分子比例不合适，沉淀物产生少，体积小，或不产生沉淀物。

（3）特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就是这些极性基的相互吸附。抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响。如有适当浓度的电解质存在，就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。若无电解质存在，则不发生可见反应。

（4）合适的pH是抗原抗体反应必要的条件之一。pH过高或过低可直接影响抗原和抗体的理化性质。

二、免疫分析

1、定义

免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。

2、分类

非标记免疫分析技术：免疫扩散、免疫电泳

标记的免疫分析技术：酶免疫分析、放射免疫分析、其它免疫分析法（荧光免疫技术、胶体金免疫技术、发光免疫技术和铁蛋白免疫技术等）

3、免疫标记技术

3.1基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。

3.2主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术

三、荧光免疫分析(Fluorescence immunoassay, FIA)

1、定义

免疫荧光技术(FIA)是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。FIA以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。

在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。

2、分类

传统的荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰，分析灵敏度较低。在这个背景下，两种现代荧光免疫分析方法迅速发展。荧光偏振免疫分析法就是其中之一。它以其快速、精确和特异的优势很快便为人们广泛接受。时间分辨荧光免疫分析是另一种现代荧光免疫分析技术。

2.1荧光偏振免疫分析方法(Fluorescence polarization immunoassay, FPIA)

（1）基本原理

FPIA是一种利用反应分子在反应体系中的旋转速度与分子大小呈反比的特点而对荧光标记抗原进行检测的技术，在免疫反应体系中抗原（相对为小分子物质）的旋转要比抗原-抗体复合物快，以荧光物质标记的抗原与待测样品中的抗原竞争结合特异性抗体，形成荧光抗原-抗体复合物，该复合物的旋转比单纯的荧光物标记抗原慢，当此时反应体系接受偏振光的照射，如荧光抗原分子的长轴与投入的偏振光面平行，那么荧光物质吸收的偏振光最多，分子呈激发态，回到基态时会发射出偏振荧光，而如果反应体系中的分子发生旋转，发射的偏振光就会减弱，减弱的程度与分子旋转的速度呈正比，与分子大小呈反比。

通常反应体系受垂直偏振光激发后，在与激发光呈适当角度处用第二个偏振器测量发射荧光强度，其偏振面既可垂直定位也可水平定位，在测定时样品中抗原浓度越低产生的荧光抗原-抗体复合物就越多，游离的荧光标记抗原越少，反之亦然，荧光抗原-抗体复合物越多，偏振光就越强。根据荧光偏振的改变测定标本中抗原的浓度，偏振光的强度与样品中抗原的浓度呈反比，用已知浓度的样品制备标准曲线，未知浓度的样品则可通过与标准曲线比较得出分析结果与传统荧光分析相比 ，具有一些优点，如均相测量方案，易于快速进行，荧光标记物质半衰期长，结果准确等。 但是由于FPIA是针对相对分子质量的大小进行测量的，

因此，对本身分子很大的物质不适合采用此方法。

（2）应用

FPIA技术在很早时便有应用于抗生素（庆大霉素）和抗癫痫药（苯妥英钠）浓度测定的报道，人们也将之用于类固醇、儿茶酚胺、高半胱氨酸等物质的体内分析。尤其适用于血清中或尿中微量半抗原的测定。FPIA也可用于中药和天然药物的检测领域等。

2.2时间分辨免疫分析方法(Time-resolved fluorescence immunoassay,  TRFIA)

1）基本原理

TRFIA是用三价稀土离子及其鳌合剂代替荧光物质或者同位素作为示踪物，标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应发生，如抗原抗体结合、生物素亲和素相互反应、核酸探针杂交反应等后，用具有时间分辨功能的时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析的目的。

目前用于TRFIA的三价稀土离子主要为镧系离子，其中铕离子最为常用。免疫反应后形成的抗原-抗体-铕标记物复合物在弱碱性缓冲液中经激发光激发所发生的荧光信号甚弱，主要因为水是稀土离子产生荧光的淬灭剂，这时须加入一种含有β-二酮体(βNTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、Triton X-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾的酸性溶液（pH值2~3），使稀土离子从鳌合物中解离下来。游离的三价铕离子在TOPO协同下，与β-二酮体形成一种新的鳌合物，非离子型的表面活性剂可以有效地将复合物形成大分子的微囊，微囊的内侧为疏水性基团能有效地溶解脂溶性的β-NTA；而其外层为亲水性基团，可以和水分子结合，这种微囊可最大限度地将能量传递给Eu3+， 从而阻断了β-NTA吸收能量传递给水所产生的淬灭效应，使原来的荧光信号增强近100万倍，大大有利于荧光测量，因此我们也称之为“解离-增强的镧系荧光免疫分析”。

（2）特点

荧光光谱独特：激发光光谱带宽，激发最大波长在300~500nm，有利于增高激发能，提高标记物的比活性；发射光光谱带很窄，甚至不到10nm，有利于降低本底，提高分辨率；

Stokes位移大：可以达到250~350nm，最大程度地排除了非特异性荧光背景的干扰；

荧光寿命长：一般镧系元素鳌合物的荧光衰变时间为60~900μs；因此，延迟测量时间，待背景荧光完全衰减后测定，所测得的便是标记物的特异性荧光，从而消除了蛋白质背景荧光的干扰；

稀土元素标记物体积小：为原子标记，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，既保证了被检测物质的稳定性，又可实现多位点标记，标记物稳定，可以保存1~2年，克服了同位素以及酶标等不稳定的缺点。

（3）应用

TRFIA多应用于临床以及免疫、生物分析领域。但是，随着近些年来生物药物的广泛开发，一些细胞因子、激素、功能性蛋白质均成为药物研制的热点，而TRFIA凭借其独有的特点，在药物分析中的应用也逐渐增多起来。

四、化学发光免疫分析

1、定义

化学发光免疫分析(Chemi-luminescence immunoassay, CLIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。

化学发光（Chemi-luminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。

2、分类

2.1直接化学发光免疫分析 (Direct chemical luminescence immunoassay, DCLIA)

基本原理：

用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。

2.2化学发光酶免疫分析 (Chemi-luminescence enzyme immunoassay, CLEIA）