动物细胞培养(2018.3.26).ppt

植物细胞工程植物细胞工程技术植物细胞工程应用植物组织培养植物体细胞杂交植植物物繁繁殖殖的的新新途途径径作作物物新新品品种种的的培培育育细细胞胞产产物物的的工工厂厂化化生生产产2021/10/101动物细胞工程动物细胞工程2021/10/102最基础的是最基础的是 动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞工程常用的技术：动物细胞工程常用的技术：l动物细胞培养动物细胞培养l动物细胞核移植动物细胞核移植l动物细胞融合动物细胞融合l生产单克隆抗体等生产单克隆抗体等2021/10/103动物细胞培养技术动物细胞培养技术2021/10/1041、简述动物细胞培养的过程、条件及、简述动物细胞培养的过程、条件及应用应用2、对比说出动物细胞培养与植物组织、对比说出动物细胞培养与植物组织培养原理、条件、结果、培养目的培养原理、条件、结果、培养目的学习目标：学习目标：2021/10/105生活联系：生活联系：烧伤病人的治疗通常烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗学们想一想如何来治疗该病人？该病人？2021/10/106思考？思考？l许多动物的细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。许多动物的细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是，单个细胞的蛋白质量是很少的，怎样才但是，单个细胞的蛋白质量是很少的，怎样才能获得大量的分泌蛋白呢？能获得大量的分泌蛋白呢？2021/10/107一、动物细胞培养一、动物细胞培养1、概念：、概念：从动物机体中取出从动物机体中取出相关组织相关组织，将它，将它们分散成们分散成单个细胞单个细胞，然后放在适宜的培养基，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞中，让这些细胞生长生长和和增殖增殖。2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖如何进行动物细胞培养如何进行动物细胞培养?2021/10/108阅读阅读“动物细胞培养过程动物细胞培养过程”并思考并思考1、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？2、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？3、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？4、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？物细胞培养材料？5、简述动物细胞培养的操作过程。、简述动物细胞培养的操作过程。2021/10/1091、为什么要对取出的动物组织进行处理，、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？使细胞分散？分散的单个细胞容易摄取所需的营养，排分散的单个细胞容易摄取所需的营养，排出代谢废物；而用大块组织培养时，内部细胞出代谢废物；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难。的营养供应和代谢废物的排出都较困难。2021/10/10102、（旁栏思考）用胰蛋白酶对动物组织进行、（旁栏思考）用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？酶可以吗？细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。胃蛋白酶作用的适宜胃蛋白酶作用的适宜pH约为约为2，当，当pH大于大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境适宜环境pH为为7.28.4。多数动物细胞培养的。多数动物细胞培养的适宜适宜pH为为7.27.4。2021/10/10113、（旁栏思考）胰蛋白酶真的不会把细胞消、（旁栏思考）胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。2021/10/10124、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？织做动物细胞培养材料？2021/10/1013定义：定义：人们通常将人们通常将动物组织动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代称为原代培养。培养。胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养（贴壁生长贴壁生长长成单层细胞。长成单层细胞。有有接触抑制接触抑制现象）现象）。原代培养原代培养3 3、过程、过程原代培养原代培养增殖能力强，分裂旺盛，分化增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养程度低，容易培养去掉组织间去掉组织间蛋白蛋白加培养液加培养液2021/10/1014强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于表面光滑、无毒、易于帖附。帖附。2021/10/1015当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细殖，这种现象称为细胞的胞的接触抑制。接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制细胞的接触抑制细胞的接触抑制思考：如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？2021/10/1016 定义：定义：当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后,用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下下来来,然后加入新的培养液然后加入新的培养液,将将细胞分离稀释细胞分离稀释,并并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这这个过程称个过程称传代培养传代培养.（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）传代培养传代培养2021/10/1017遗传物质未遗传物质未改变改变 原代细胞原代细胞1050代细胞代细胞(细胞株细胞株)遗传物质己遗传物质己改变改变无限传代（无限传代（细胞系细胞系）分瓶分瓶传代培养传代培养胰蛋白酶胰蛋白酶原代培养原代培养细胞贴壁细胞贴壁接触抑制接触抑制传代培养传代培养2021/10/1018细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。强调：细胞株、细胞系（了解即可，老课本体系）2021/10/1019总结：动物细胞培养过程总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的动物胚胎或幼龄动物的组织、器官组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎、用胰蛋白酶处理剪碎、用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶10-5010-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变遗传物质不改变传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以代左右，增长缓慢以至于完全停止，至于完全停止，部分细胞核型可部分细胞核型可能发生变化能发生变化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）分瓶分瓶传代培养传代培养原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。细细胞胞株株：一一般般说说遗遗传传物物质质未未改改变变细细胞胞系系：遗遗传传物物质质已已改改变变原原代代培培养养2021/10/1020多细胞动物和人体的细胞都生活多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养动物细胞应该模拟认为体外培养动物细胞应该模拟内环境的哪些条件呢？内环境的哪些条件呢？问题探讨：问题探讨：2021/10/10214.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒 的环境：液体合成培养基：液体合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素水、无机盐、微量元素等；通常还需加入等；通常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。2021/10/1022旁栏思考：动物血清的作用旁栏思考：动物血清的作用？主要是：提供有利于细胞生长增殖所需主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质等。缺乏的营养物质等。2021/10/10234.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒 的环境：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：液体合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素水、无机盐、微量元素等；通常还需加入等；通常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。2021/10/1024 生物制品的生产生物制品的生产 用于基因工程用于基因工程 用于检测有毒物质用于检测有毒物质 细胞的生理、病理、药理研究细胞的生理、病理、药理研究 5、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用2021/10/1025获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性植物体植物体培养结果培养结果或细胞产物或细胞产物快速繁殖快速繁殖、培育培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、葡萄糖、动物动物血清血清蔗糖、植物蔗糖、植物激激素素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较细胞群体细胞群体2021/10/10261 1动物细胞工程常用的技术手段中，动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是最基础的是 A.A.动物细胞培养动物细胞培养 B.B.动物细胞融合动物细胞融合 C.C.单克隆抗体单克隆抗体 D.D.胚胎核移植胚胎核移植练一练练一练Lets try!2 2贴壁细胞的分裂方式具体是贴壁细胞的分裂方式具体是 A.A.无丝分裂无丝分裂 B.B.有丝分裂有丝分裂 C.C.减数分裂减数分裂 D.D.增殖增殖2021/10/10273 3关于动物细胞培养的叙述，不正确的是关于动物细胞培养的叙述，不正确的是 A.A.动物细胞培养前要用胰蛋白酶或胶原蛋白动物细胞培养前要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散开来酶使细胞分散开来 B.B.通常将动物组织消化后的初次培养称为原通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养代培养 C.C.动物细胞培养只能传动物细胞培养只能传5050代左右，所培育的代左右，所培育的细胞全部衰老死亡细胞全部衰老死亡 D.D.用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织的器官或组织 练一练练一练Lets try!2021/10/1028 根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达?再想一想利用动物体细胞核移植技术利用动物体细胞核移植技术2021/10/1029理论基础：理论基础：动物的细胞核具有全能性动物的细胞核具有全能性二、动物体细胞核移植技术二、动物体细胞核移植技术2021/10/1030二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义：将动物的将动物的一个细胞的细胞核一个细胞的细胞核,移移入一个已经入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中去掉细胞核的卵母细胞中.使其使其重组并发育成一个重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎,这个新的胚胎这个新的胚胎最终发育为最终发育为动物个体动物个体.3、分类：分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难2、原理：原理：动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性2021/10/1031供体细胞培养（M卵母细胞）卵母细胞）减数第二次分裂中期减数第二次分裂中期去核的卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞激活受体细胞，激活受体细胞，完成分裂、发完成分裂、发育育胚胎移植胚胎移植代孕牛子宫代孕牛子宫克隆牛克隆牛4、过程：、过程：2021/10/1032供体细胞供体细胞（供核）（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞卵巢卵母细胞卵巢卵母细胞（M中期：供质）中期：供质）去核去核无核卵无核卵母细胞母细胞注入注入细胞细胞融合融合重重组组细细胞胞构建重构建重组胚胎组胚胎胚胎胚胎移植移植代孕代孕母体母体生出与供体遗生出与供体遗传基本相同的传基本相同的个体个体归纳归纳:1.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植核移植和和胚胎移植胚胎移植2.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状两个亲本的性状核移植过程2021/10/1033加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育保护濒危物种，增加存活数量保护濒危物种，增加存活数量克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白可以作为异种移植的供体可以作为异种移植的供体5、应用前景：、应用前景：可以用于组织器官的移植可以用于组织器官的移植2021/10/10346、存在问题：、存在问题：成功率低成功率低克隆动物存在健康问题克隆动物存在健康问题克隆动物食品的安全性问题存有争议克隆动物食品的安全性问题存有争议2021/10/10351.1.从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入到母羊乙的去核卵母细胞中，融合后的细到母羊乙的去核卵母细胞中，融合后的细胞经卵裂形成早期胚胎，再将胚胎移到另胞经卵裂形成早期胚胎，再将胚胎移到另一只母羊丙的子宫内，出生的小羊大多数一只母羊丙的子宫内，出生的小羊大多数性状性状 A.难以预测难以预测 B.像甲像甲C.像乙像乙D.像丙像丙 练一练练一练Lets try!2021/10/10362.2.下列有关克隆的叙述，不正确的是下列有关克隆的叙述，不正确的是A.A.生物体通过体细胞进行的无性繁殖生物体通过体细胞进行的无性繁殖 B.B.将某种瘤细胞体外培养繁殖成大量细胞将某种瘤细胞体外培养繁殖成大量细胞C.C.扦插和嫁接实质上也是克隆扦插和嫁接实质上也是克隆 D.D.将鸡的某个将鸡的某个DNADNA片段整合到小鼠的片段整合到小鼠的DNADNA中中练一练练一练Lets try!2021/10/10372021/10/10381、动物细胞培养的过程：、动物细胞培养的过程：幼龄动物幼龄动物取动物器官取动物器官和组织和组织剪碎组织剪碎组织胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理细胞培养细胞培养单个细胞单个细胞加培养液加培养液2021/10/1039细胞悬液细胞悬液10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变1、动物细胞培养的过程：、动物细胞培养的过程：2021/10/1040问题问题1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？是什么成份？没有没有是是成块的组织细胞靠在一起成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理后用蛋白酶处理胰蛋白酶水解蛋白质胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质细胞间的成份是蛋白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)2021/10/1041思考题、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？散成单个细胞要注意什么问题呢？、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？1010、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？动物的组织或器官，请解释原因？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂能能注意时间的控制注意时间的控制不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织细不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛2021/10/104211、贴附性细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？、贴附性细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？增殖？13、如果此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎、如果此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？细胞株和细胞系通常是培养多少代的细胞样办？细胞株和细胞系通常是培养多少代的细胞?易于培养易于培养细胞贴壁细胞贴壁，进行生长增殖进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增将贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养殖。这样的过程叫做传代培养思考题2021/10/104314、如何理解原代培养和传代培养？、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去吗？动物细胞培养就是为、有些为何能一直传下去吗？动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？了得到这些细胞吗？17、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？用于植、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？用于植皮的细胞培养应该不多于多少代？皮的细胞培养应该不多于多少代？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养不是都能不是都能发生突变，朝着癌细胞方向发展发生突变，朝着癌细胞方向发展不是不是保存保存10代以内的细胞；因为代以内的细胞；因为1050部分细胞的细胞部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展；向发展；10代代思考题2021/10/1044 体细胞核移植方法生产的克隆牛是对卢体细胞核移植方法生产的克隆牛是对卢辛达进行了辛达进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细来自供体细胞核，但核外还有少部分胞核，但核外还有少部分DNADNA（如线粒体（如线粒体DNADNA）来自受体卵母细胞。此外，还会受）来自受体卵母细胞。此外，还会受到不同环境的影响到不同环境的影响思考：思考：2021/10/1045