1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,扫描电镜样品的制做与观察,解放军总医院骨科研究所,黄靖香,1,目的,随着组织工程技术的发展兴起，如支架材料,的制作后，需观察样品中的孔径大小，与细,胞的相融性，生长形态变化等。用扫描电镜,观察获得清晰图像，是重要的检测手段之一。,2,电子显微镜分透射和扫描电镜两种，透射电,镜（,TEM,）是观察样品中的内部结构：如细,胞器等；扫描电镜（,SEM,）可观察样品中的,表面形态结构。,3,4,5,扫描电镜的优点,景深长，视野广，图像呈三维立体结构，样,品制作较透射电子显微镜简单，功能多，根,据样品性质不同，其处
2、理方法也有所区别，,下面主要介绍组织工程支架、细胞、细胞外,基质等样品的制作技术。,6,一,.,样品制作处理步聚,取样清洗第一次固定（戊二醛）第二,次固定（锇酸）缓冲液中漂洗梯度脱水,醋酸戊酯置换临界点干燥（改成六甲基,二硅胺烷,HMDS,代替临界点干燥）表面喷,镀扫描电镜中观察。根椐我们的具体情况,加以改进。,7,1.,材料准备、液体配制：,1,）玻璃器皿需泡酸、蒸溜水清冼后灭菌备用。,2,）磷酸缓冲液（,PBS-0.1M PH-7.4,）配制：磷,酸二氢钠,2.964g,磷酸氢二钠,29.011g,加三蒸水,1000ml,，也可用不加酚红无菌,Dhankes,液代替。,3,）固定液的配制：
3、用,PBS,缓冲液配成,2.5%,戍,二醛和,1%,的四氧化锇。,8,2.,取材准确、固定及时：尽可能保存原貌，,大小适宜（,10mm,2,高,5mm,左右），对样品表面,用无菌,Dhankes,液清洗,2,次，迅速用,2.5%,戍二,醛,4,度下前固定,4h,以上。,3.,观察样品前两天，,PBS,洗,20,分钟,/,次,2,次，,以下均在室温下，通风橱中进行。,4,1%,四氧化锇酸后固定,2h,。,9,缺插图 托上加图片 饿酸固定加图片 单宁酸加图片,10,11,5,重复步骤,3,。,6.2%,单宁酸过滤后洗,2,次，每次,30min,。,7,重复步骤,3,。,8.,梯度乙醇脱水（,50
4、75 90 100,）,%2,次，每 次,30min,，也可在,75,或,90%,乙醇中过夜。,9.,醋酸异戊酯置换乙醇,40min,。,12,10.,六甲基二硅胺烷原液（,HMDS,）,5-10min,替,代临界点干燥，放青霉素瓶中抽真空后密,封。,11.,样品用导电胶贴牢贴平，正面朝上，大小,适宜。置蒸空干燥器内过夜。,12.,第三天早晨，用离子溅射真空镀膜法喷镀,导电金属。,13.,上机观察样品，照相获得二次电子图像。,13,14,15,二,.,比较不同干燥方法的优缺点,材料分类,A,单纯支架材料：看孔隙率和孔径大小分布，用普通冷冻 干燥机冷冻干燥法干燥,48h,的支架粘贴后喷金上机观看
5、干燥喷镀上机观察,16,B.,活细胞不处理环镜扫描直观看细胞,活细胞环镜扫描图,17,C.,细胞常规梯度脱水：用冷冻干燥机处理 细胞收缩，断裂，立体感差。,冷冻干燥细胞裂缝 冷冻干燥细胞收缩,18,D.HMDS,法替代临界点干燥,:,处理细胞加支架,HMDS,处理后的图像,19,E.HMDS,法替代临界点干燥,:,处理细胞加支架微细结构的观察：纳米材料,(ECM),猪,ECM,胶原 犬神经胶原,20,脐带,ECM,胶原 背根神经节基质,21,F.,常规脱水临界点干燥处理后的样品和六甲基,=,硅胺烷（,HMDS,）处理的比较,常规处理,HMDS,处理,22,三 注意事项和要求,1.,取材大小适
6、宜，准确定位，首先洗去赘生物后立即固定，防组织细胞的结构自溶或变形。污染物造成图像表面出现絮状物，轮廓不清。,2.,根据不同样品，采用不同的干燥方法，防止因干燥时间过长，压力过大造成样品过度收缩和断裂。样品厚而贴不牢不平，造成喷镀不均，样品边缘空白，发亮而出现充电现象和边缘效应。图像漂移。为此可降低电压（,1-5 KV,）减少充电和边缘效应。,3.,用单宁酸的目的为提高二次电子发射率，耐受电子轰击，防止样品断裂。,23,4.,样品脱水干燥贴牢后，需放置玻璃密封真空（加干燥剂）干燥器皿内。样品喷镀后，最好当天观察，照相,如看不完，还需放干燥器中密封真空保存，防灰尘潮气进入。最好勿超过,3,个月。,5.,因条件有限，无临界点干燥仪，我们采用六甲基二胺烷（,HMDS,）代替临界点干燥仪，优点是快速经济，不受仪器限制，看普通标本，组织细胞支架材料，与常规临界点干燥处理效果基本一致；看精细材料（,ECM,）的分辨率还是有差距。,6.,胶原纤维样品梯度脱水前的漂洗液我们采用无菌的三蒸水洗,2,次，防止盐结晶沉积在样品表面，影响与超微纳米胶原的混淆。,24,
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