生物芯片技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物芯片技术(,BIOCHIP TECHNOLOGY),1,研究历史,(Research history),1991 Affymatrix公司Stephen Fodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNA Chip概念,Stanford大学Brown实验室：预先合成,，机械手阵列,1995 Schena等：基因表达谱,1996 Chee et al：DNA测序,1996 Cronin et al：突变检测,1996 Sapolsley&Lipshutz：基因图克隆,1996 Shalon et al：复杂DNA样本分析,1996 Shoemaker et al：缺省突变定量表型分析,第十章 生物芯片技术,生物芯片（biochip）的概念,指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,根据生物分子之间特异性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小的载体表面，通过分子之间的特性性反应，检测另外一方有无、多少或者结构改变等,生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。,未来十年最具发展潜力的技术。,第十章 生物芯片技术,生物芯片的主要特点：,高通量、微型化和自动化,常用的生物芯片的分类：,基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室,特点,高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。,多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。,微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。,自动化：降低成本，保证质量。,第十章 生物芯片技术,基因芯片,（,Genechip,）,又称,DNA,芯片,是根据核酸杂交的原理，将大,量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品,进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进,行分析。,第十章 生物芯片技术,2.,蛋白质芯片(proteinchip),利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应,的原理,，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固,相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。,第十章 生物芯片技术,芯片实验室,(,labs-on-chip),高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。,实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。,芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。,其他分类方法（根据应用）,基因变异检测芯片,疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌),法医鉴定(如DNA指纹图谱),表达谱芯片,肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异),药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异),发育(同一组织不同发育时期基因表达差异),组织发生(不同组织或器官的基因表达差异),根据工艺和载体,1.原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。,2.DNA微矩阵法,：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶玻璃等，DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。,根据DNA成分,寡聚核苷酸或DNA片段：约20,25个核苷酸碱基，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）。,全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。,基因芯片的种类,Science Chip：,生物分析和诊断,Nutri Chip：食物分析、转基因、污染检测,Leuko Chip：血液分析、病毒分析、HLA分析,Aqua Chip：水质分析,Secure Chip：含DNA的物质鉴定,Chromo Chip：基因分析和染色体序列,Prokaryo Chip：原核生物、兽医、环保等,第十章 生物芯片技术,第二节 蛋白质芯片,第一节 DNA芯片,第一节 DNA芯片,17,第一节 DNA芯片,DNA芯片技术包括四个主要步骤,芯片的设计与制备,样品制备,杂交反应和信号检测,结果分析,生物芯片技术主要环节,芯片制备：微点阵,样本制备：DNA提纯、扩增、标记,杂交：样本与互补模板形成双链,检测：共聚焦扫描，双色激光,数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。,结果,第一节 DNA芯片,第一节 DNA芯片,二、样品的制备,三、杂交与结果分析,四、基因芯片技术在医学中的应用,一、芯片制备,一、芯片制备,基因芯片制备主要包括两个方面,探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针探针在芯片上的布局：选择合适的方式将探针排布在芯片上。,一、芯片制备,（二）DNA芯片的制备,（一）探针的设计,（一）探针的设计,表达型芯片探针的设计,不需要知道待测样品中靶基因的精确细节,序列的特异性应放在首要位置,单核苷酸多态性检测芯片探针的设计,等长移位设计法,特定突变位点探针的设计,叠瓦式策略,一、芯片制备,一、芯片制备,图102,（二）DNA芯片的制备,1载体选择与预处理,载体：用于连接、吸附或包埋各种生物分子并使其以固相化状态进行反应的固相材料。,载体材料：玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和聚丙烯膜等。,载体的化学处理：活化剂多聚赖氨酸,氨基硅烷偶联剂,一、芯片制备,2基因芯片制备,（1）原位合成（in situ synthesis）,光导原位合成法,原位喷印合成,分子印章多次压印合成,（2）点样法,芯片制备,原位合成法（,in situ synthesis):,又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。,一、芯片制备,图103,合成后交联（,post-synthetic attachment):,利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或,cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。,两种制备方法比较,原位合成测序、查明点突变,高密度、根据已知的DNA编制程序,制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列,合成后交联：,比较分析,制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化，,交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯,片。中、低密度，样品浪费较多且制备前需储存,大量样品。,二、样品的制备,样品的制备过程包括,核酸分子的纯化、扩增和标记,样本制备,制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。,用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。,样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。,三、杂交与结果分析,（一）杂交反应：与传统的杂交方法类似,（二）杂交信号的检测：最常用荧光法,（三）数据分析：芯片杂交图谱的处理与存储由专,门设计的软件来完成。,杂交,是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步,液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。,选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。,合适长度的DNA有利于与探针杂交。,温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。,最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。,结果分析,芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据：,共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。,质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。,化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。,芯片扫读装置,根据采用的光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。,根据激光光源，可分为激光型和非激光。,应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。,图象分析,复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。,分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。,图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。,四、基因芯片技术在医学中的应用,基因表达分析,基因型、基因突变和多态性分析,疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤,药物筛选,指导用药及治疗方案,预防医学,四、基因芯片技术在医学中的应用,生物芯片分析原则,1、测定过程应包括五个基本步骤：,需解决的生物学问题,样本制备,生物化学反应,检测,数据分析,2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。4、所有基因分析必须平行处理。5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。7、检测系统必须能精确地获得数据。8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。,9、两种或以上平行数据组比较应受到单 个实验所固有特性的限制。10、绝对比例关系只存在于组合实验的平 行数据组内。11、平行格式包括内在和外部的整个系统 误差的分析因素。12、在每个系统模块中采集到该系统所有 变量的四维数据时，才能称为完成生 物系统平行基因分析。,生物芯片技术的12条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可参见cmgm.stanford.edu/schena/Blot(证实某一基因的相对表达水平)、Western Blot(RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。,第二节 蛋白质芯片49,第二节 蛋白质芯片,蛋白质芯片（protein chip）,又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。,第二节 蛋白质芯片,根据制作方法和应用的不同，蛋白质芯片分为两种,蛋白质功能芯片,细胞中的每一种蛋白质占据芯片上一个确定的,点，主要是高度平行地检测天然蛋白质活性。,蛋白质检测芯片,将能够识别复杂生物溶液（如细胞提取液）中,靶多肽的高度特异性配体进行点阵。这种芯片,能够高度并行的检测生物样品中的蛋白质。,第二节 蛋白质芯片,第二节 蛋白质芯片,蛋白质芯片技术在医学中的应用,特异性抗原抗体的检测,生化反应的检测,疾病诊断,对疾病分子机制的研究,药物筛选及新药的研制开发,抗体和蛋白质阵列技术,蛋白质组学(protiomics)的兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术的发展。,Pareick Brown使用特异性抗体微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋白质。,Leuking等采用蛋白质微阵列技术，测定了10pg的微量蛋白质，并证实假阳性极低。,乳腺癌基因芯片,Stanford 乳腺癌微矩阵(Perou et al.1999),每种基因的数据以行表示，每个实验用列表示。,颜色强度表示对照和实验cDNA的比率。比率相同时为1。,结果为红色表示mRNA增加，绿色表示减少，灰白色表示缺乏。,两种基因的相似性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算。,DNA微矩阵分析软组织肉瘤表达,Kavine Maillard et al(1999),cDNAs,进行DNA表达矩阵，PCR产物包被在经赖氨酸处理的玻片上，用Cys3-和Cys5-标记的cDNA进行杂交，洗涤后用Scanarray3000扫描仪测定矩阵，表达数据储存在ACeDB数据库中，根据数据表达类型区分不同的基因。,微矩阵分析DNA和蛋白表达,Holger Eickhoff et al.(1999),根据已有的序列数据，组合800000人类EST序列，已重矩阵了38000克隆用于RNA表达分析，克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定19200个基因片段，标记人组织RNAs与被选的38000人基因片段的矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织的图象，用软件分析点识别和点定量。,使用寡聚核苷酸鉴定新的cDNA克隆，和进入表达载体，使相应蛋白能直接表达，矩阵后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的关系。,生物芯片相关仪器,点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。,杂交仪：全自动完成调节、加探针、漂洗和热循环的杂交过程。,扫描仪：激光共聚焦或CCD直接成像分析结果。微矩阵仪器介绍,Q Bot,Q Pix,Q Array,Q Pet,Q Soft 2000,Q Bot,超高解析基因筛选暨排列分析仪。,基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h,基因排列打点(Gridding)：100000/h,基因复制(Replication)：96,96,96,384,基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘,基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片,全自动液体分注系统(Liquid Handling):96,针，注液量1,200l，适合PCR产物。,分析软件：分析、质控、上网。,环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板,Q Pix,半敞开式基因筛选暨排列分析仪(经济型),基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h,基因排列打点(Gridding)：100000/h,基因复制(Replication)：96,96,96,384,基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘,基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片,分析软件：分析、质控、上网,环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板,Q Array,第三代半敞开式基因微矩阵排列仪。,基因微矩阵排列(Microarrying)：同时处理84片玻片，每一打点玻片分4个区域，可安排不同的矩阵排列。可选16或24针座。,仪器容量：玻片84片，玻片架6个，384孔板5盘。,分析软件：分析、质控、上网。,环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板。,自动液体处理系统。,杂交仪,Affymetrix 640杂交仪：,温度范围：0,100C,探针用量：l,流速：10ml/min,样本区：2.46.4cm,扫描仪,Genearray,TM,扫描仪：,激光：氩离子,488nm,适用染料：荧光素、藻红素,单扫描时间：4分钟,分辨率：3、6、9或24微米,生物芯片技术的发展,发展趋势,微型化：DNA矩阵越来越小。,集成化：矩阵上的基因组越来越大,。,多样化：测定范围越来越广。,微量化：测定所需样本越来越少。,全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。,定量化：如激光捕获技术，显微解剖技术等可精确测定一个细胞内的一个基因的表达。,DNA矩阵数据信息库的完善。,生物芯片技术的发展,技术,毛细管电泳芯片技术,PCR芯片技术(PCR-Chip),缩微芯片实验室(lab-on-a-chip),微珠芯片技术(beadArray),抗体和蛋白质阵列技术(Antibody and protein-array technology),自我定制芯片技术（,make your own chip),血气分析芯片,毛细管电泳芯片技术,Mathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在10分钟内完成了对433个碱基序列的测定。,宾夕法尼亚大学Wilding等成功地利用毛细管电泳芯片分离了用于诊断杜鑫-贝克肌萎缩的多条DNA片段。,瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸的分离。,缩微芯片实验室,在一张芯片上完成样品(如血液、组织等)制备、化学反应、检测和数据分析。,1998年程京博士首次应用LOC实现了从样品制备到反应结果显示的全部过程，成果地从混有大肠杆菌的血清中分离出了细菌。,含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经问世。也已出现样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片。,LOC与卫星传输和网络生物信息学结合，将实现高通量、一体化和移动性的“未来型掌上实验室”的构想。,control,Ex5-siRNA,思考题,1.名词解释,生物芯片,DNA芯片,蛋白质芯片,2.表达芯片的探针如何设计？,3.基因芯片的应用价值,4.芯片技术的基本流程,