各种印迹法的详细介绍.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,印迹法（,Blotting,）技术简介,李娟 马晓伟,oct18,2010,定义：,印迹法,（,Blotting,）,是指将样品转移到固相载体上，然后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,Southern blotting,1975,年，,Edward M.Southern,建立了将,DNA,转移到硝酸纤维素膜,（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,杂交检测特定的,DNA,片段的方法,Northern blotting,1979,年，,McMaster,和,Carmichael,对,RNA,进行印迹分析，发明,Northern,印迹技术,Western blotting,1979,年，,George Stark,对电泳后的蛋白质分子进行印迹分析从而,发明,western,印迹技术,概述,生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化膜上。,蛋白质分析中应用的,Western,杂交方法与,DNA,分析应用中的,Southern,杂交法,RNA,分析中的,Northern,杂交法相似，均是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体上，并均以针对特定氨基酸或核苷酸序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。,Southern Blotting,DNA,提取 琼脂糖电泳,印迹转移 预杂交 杂交（变性探针）洗膜 放射自显影或显色,Northern Blotting,RNA,提取 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针）洗膜 放射自显影或显色,Western Blotting,基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至膜上，然后用这种多肽的特异抗体来检测,。,Western Blotting,操作流程,蛋白样品的制备,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电,泳,转膜,封闭,一抗孵育,二抗孵育,底物显色,使用的仪器,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.,聚丙烯酰胺凝胶电泳,迁移率主要依据其,分子量,和电荷,的差异及,形状,等因素,2.SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,迁移率主要依赖于蛋白质大小,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理,：,SDS,是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,SDS,与蛋白质结合后使,SDS-,蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均,每两个氨基酸残基结合一个,SDS,分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被,SDS,掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的条带带也为蛋白质的亚基,SDS-PAGE,分离胶配方,SDS-PAGE,浓缩胶配方,电泳,上层浓缩胶的电泳电压要,低于,分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶。,电泳时，应采用恒压的模 式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。,一般采用恒压浓缩胶,80V,，,30min,分离胶,110V,时间视所要检测的蛋白分子量及胶浓度而定。,转膜后检测,丽春红染色,丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带，丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用,PBS,或,TBS-T,溶液洗去,封闭,脱脂奶粉（,5,）,BSA,（牛血清白蛋白）,Western Blotting,膜封闭液,洗转印膜：,室温用,TBS-T,漂洗,3,次,x10min,以尽量洗去转印膜上的,SDS,，防止影响后面的抗体结合。,2),取漂洗的转印膜，放入,5%No-fat milk,的封闭液内，摇床震动，室温封闭,2h,，也可在,4,度过夜。,3),用,1xTBS-T,，,PH7.6,洗液，室温漂洗,3,次,x10min.,一抗、二抗孵育,1.,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据抗体效价选择合适的抗体浓度，将一抗溶液与滤膜温育。室温,6,小时左右，,4,过夜,2.,倒掉一抗溶液，用,TBS-T,漂洗液滤膜,3,次，每次,7min,3.,加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温,2,小时,4.,倒掉二抗溶液，用,TBS-T,漂洗液滤膜,3,次，每次,7min,即可准备显影,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（,HRP,）,将,在暗室中将显色剂,A,B,溶液按,1,：,1,混合，后均匀涂抹在膜上结合有二抗的地方即可催化底物发出荧光,将胶片贴在膜的发光区上，根据荧光强弱选择合适的曝光时间,曝光结束后将胶片放入显影液中至出现条带后再放入定影液中,转膜：膜的选择，转膜方法取舍,样品处理,Western blotting,常见问题分析及其应用,马晓伟,膜的选择,转膜,-,膜的选择,硝酸纤维素膜（,NC,膜）,价格便宜，简单快速封闭与非特异性抗体结通常有,0.45,m,和,0.2,m,两种规格的,NC,膜，大于,20kD,的蛋白可用,0.45,m,的膜，小于,20kD,的蛋白就要用,0.2,m,的膜了，如用,0.45,m,的膜就会发生,“,Blowthrough,”,的现象。,聚偏氟乙烯膜,（,PVDF,膜）,PVDF,膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，对蛋白的吸附能力要远远大于,NC,膜,非常适合于低分子量蛋白的检测，小分子更不容易渗透下去，截留率高，用之前需在甲醇溶液中浸泡,10min,。,转膜,-,转膜方法的选取,常用的有湿转和半干转,湿转：,湿转是一种传统方法，将胶,/,膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用的大胶比较困难。,转膜操作流程,转膜,转膜电流不予太大，否则容易使膜和胶烧坏，仪器最大电流为,400mA,转膜时间根据目的蛋白的分子量而定，分子量越大，转膜时间越长,关于转膜的注意事项：,1.,胶在负极，膜靠近正极；,2.,转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放,4,冰箱；,4.,滤纸不要大过膜，防止短路；,5.,夹好膜和凝胶后，确定在凝胶,/,膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全；,6.,注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉；,7.,在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。,半干转,半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（,15-45,分钟）又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。,半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。,两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡,，气泡,阻碍转移并在印迹膜上产生,“,秃斑即非转移区）,。小,分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（,100KD,以上）建议湿转,干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以,1.5mA/cm2,凝胶面积转移,1-2,小时。负载电压不宜超过,1V/cm2,胶面积。,样品处理,1,培养的细胞（定性）：,去培养液后用温的,PBS,冲洗,23,遍（冷的,PBS,有可能使细,胞脱落）。,对于,6,孔板来说每孔加,200300l,，,6080,的,1loading buffer,。,100,，,1min,。,用细胞刮刮下细胞后在,EP,管中煮沸,10min,，期间,vortex 23,次。,用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将,EP,管置于,0,后在,1400016000g,离心,2min,，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用,1ml,注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。,待样品恢复到室温后上样。,2,培养的细胞（定量）：,去培养液后用温的,PBS,冲洗,23,遍（冷的,PBS,有可能使细胞脱落）。,加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上,1020min,。,用细胞刮刮下细胞，收集在,EP,管后,按比例加入,loading-Buffer,（含,DTT,）,100,，,10min,。,12000g,离心，,4,，,2min,。,取少量上清进行定量将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加,loading buffer,后直接上样最好，剩余溶液（溶于,1loading buffer,）可以低温储存，,-70,一个月，,-20,一周，,4 12,天，每次上样前,98,，,3min,。,3,组织：,匀浆,对于心肝脾肾等组织可每,50100mg,加,1ml,裂解液，肺,100200mg,加,1ml,裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。,12000g,离心，,4,，,2min,。,取少量上清进行定量。,将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加,loading buffer,后直接上样最好，剩余溶液（溶于,1loading buffer,）可以低温储存，,-70,一个月，,-20,一周，,4 12,天，每次上样前,98,，,3min,。,western,显色的方法主要有以下几种,i.,放射自显影,ii.,底物化学发光,ECLiii.,底物荧光,ECFiv.,底物,DAB,呈色,现常用的有底物化学发光,ECL,和底物,DAB,呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光,ECL,。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用,HRP,标记）：反应底物为过氧化物,+,鲁米诺，如遇到,HRP,，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。,Western Blotting,常见问题分析SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶板洗刷干净,加入,APS,和,TEMED,的量要合适,加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀,温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓,拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲,样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄，,“,三明治,”,结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸,确保膜和胶块之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,原因,对,策,转膜前用转膜缓冲液将膜完全浸湿,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度,数据处理及结果分析,1.Photoshop,软件,2.Image J,软件,3.Excel,软件,4.Graphpad prism,软件,Western bloting,的应用,生物学领域：各种刺激下细胞某种蛋白的表达情况、粘放菌,5519I,型菌毛鉴定,医学领域：骨折的愈合、肿瘤发生机制、糖尿病大鼠角膜上皮细胞,HIF-1,蛋白表达量及组织工程骨修复骨缺损的机制等病理生理学研究主要采用免疫组化的方法,其它,梯度胶,有专门的梯度胶制胶器，原理是根据不同的推进速度而将两种不同浓度的胶加以混合而成,Thank you for your attention!,