实验-SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDSPAGE测定蛋白质 相对分子质量,【目的要求】,学习,SDS-PAGE,测定蛋白质分子量的原理。,掌握垂直板电泳的操作方法。,运用,SDS-PAGE,测定蛋白质分子量及染色鉴定。,【实验原理】,电泳,带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象,。,PAGE,聚丙烯酰胺凝胶（,PAG,）是由,单体,丙烯酰胺,(,Acr,),和,交联剂,甲叉,双丙烯酰胺,(,Bis,),在,加速剂,四甲基乙二胺,(,TEMED,),和,引发剂,过硫酸铵,(AP),的作用下,聚合交联而成的三,维网状结构的凝胶,以此凝胶作为支持介质的电泳称为,PAGE,。,PAGE,具有电泳和分子筛的双重作用。,CH,2,=CH,C=O,NH,2,丙烯酰胺,N,N-甲叉,双丙烯酰胺,CH,2,=CH,C=O,NH,CH,2,NH,C=O,CH,2,=CH,聚丙烯酰胺,CH,2,-CH,C=O,NH,2,CH,2,-CH,C=O,NH,CH,2,NH,C=O,CH,2,-CH,CH,2,CH,C=O,NH,2,CH,2,-CH,C=O,NH,2,CH,2,-CH,CH,2,-CH,CH,2,-CH,C=O,NH,2,CH,2,-CH,CH,2,-CH,(),n,(),n,(),m,(),m,PAG,机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，,改变,Acr,浓度或,Acr,与,Bis,的比例可以得,到,不同孔径的凝胶。,PAGE,分为连续系统和不连续系统两大类。,连续系统,电泳体系中,缓冲液,pH,值与凝胶中的相同,.,带电颗粒在电场作用下，主要,靠电荷和分子筛效应,。,不连续系统中,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，,还具有,浓缩效应,，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,SDS-PAGE,是在蛋白质样品中加入,SDS,和含有巯基乙醇的样品处理液，,SDS,是一种很强的,阴离子表面活性剂,，它可以,断开分子内和分子间的氢键,，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。,【SDS-PAGE基本原理强还原剂巯基乙醇,可以,断开二硫键,破坏蛋白质的四级,结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解,聚后的侧链与,SDS,充分结合形成带负电荷的,蛋白质,-SDS,复合物,。,蛋白质分子,结合,SDS,阴离子后，所带负电荷的量远远超,过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所,带净电荷的差异。,蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基,的相对分子质量。,而与其所带电荷的性质无关,。,有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在,SDS,和,巯基乙醇,作用下，解离成亚基或单条肽链，因此,这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的,MW,。,将已知分子量的,标准蛋白质,在,SDS-PAGE,中的电泳迁移率,对分子量的对数作图,，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。,当蛋白质的分子量在,17,000,165,000,之间时，,蛋白质,-SDS,复合物,的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：,lgMW,=K-,bm,1）分离胶的制备,配制12%分离胶。在烧杯中依次加入,重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10%过硫酸铵50ul和TEMED 10ul（两块胶的量）,。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，,37,烘箱下聚合（约,30 min）。,2、,凝胶的制备,3、蛋白质样品的处理,1）标准蛋白质样品的处理,低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B,MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400,开封后，沸水浴中加热3-5,min,后上样。,2）样液的准备,用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。,将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关设置电压为,110V,，,电泳80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。,5、,电泳,4、加样,用移液器分别取,10,l,样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。,7、结果处理,量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率m,R,：,相对迁移率m,R,=,蛋白质样品迁移距离(cm),溴酚蓝区带距加样端距离(cm),6,、染色与脱色,电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色60 mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。,【思考题】,1、,在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作用分别是什么？,2、,在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的作用是什么?,3、,样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,Staking gel,Separating gel,