分离化学-06课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,管壁改性与选择性,选择性：溶质迁移的相对次序,不同的操作模式，由于不同的机理，会产生不同的选择性,区带电泳：改变pH，离子强度，添加剂,通过对毛细管柱内壁的改性也可达到目的,三、管壁动态改性,1 改变缓冲液的pH值，采用极高或极低的pH值缓冲液,-通过消除壁和溶质的电荷差来减少库仑相互作用,pH低，电渗流接近完全消除,pH高，电渗流非常快,2 采用高缓冲液离子强度或浓度，通常电渗减少，但焦耳热增加,3 加入添加剂,优点：稳定,原因：改性剂在缓冲液中，脱活过程连续产生,添加剂的类型：,1 各类不同的亲水聚合物2 表面活性剂,阴离子型（SDS）、阳离子型（CTAB）、非离子型、两性离子型,作用：,一是表面活性剂同电场的相互作用,二是溶质的疏水粒子和烷基键之间的相互作用，除与溶质相互作用，还可吸附到毛细管壁表面，限制溶质吸附，使蛋白质不可逆脱活，或改变电渗流，甚至反向。,缺点：,1 溶质与毛细管壁表面会因此受到影响,2 需要较长的平衡时间以得到一个可重复的表面和恒定的电渗流,3 如检测器为质谱等方法，对添加剂较为敏感，对结果可能造成影响,有机添加剂,甲醇,乙腈,三氟乙酸酐(TFA),改变电渗(通常减少),改变选择性(电动色谱或手性分析),金属离子,K,+,，Na,+,，Cu,+2,在电动色谱和凝胶电泳中改变选择性,氢键型,可溶性试剂,尿素,使毛细管凝胶电泳中的双链DNA熔融,溶解蛋白质,在电动色谱中改变选择性,络合试剂,硼酸盐,用于糖和萘酚的分离,季铵盐,二氨基丙烷,离子对,电渗反向剂,Ultraviolet(紫外检测),Laser-induced fluorescence(激光诱导荧光检测),Refractive index(折射指数检测),Mass spectrometry(质谱检测),Raman spectrometry(拉曼光谱检测),Electrochemical detection(电化学检测),Electrochemiluminescence(电化学发光检测),Modes of detection,高效毛细管电泳电化学检测研究及其应用,3.1 检测模式,3.2 检测池与电泳系统的连接,3.3 微电极在,CEEC,中的应用,3.4 电化学发光检测,响应不依赖于光路长度，可用极细的毛细管而不牺牲信号,选择性好，只响应有电化学活性的物质,电化学检测器制作简单，造价低廉,固定电位法,脉冲安培检测(PAD),间接安培检测,电位法,电导法,安培法,当被分离的电活性物质流经电极表面时，由于溶液与电极间存在电势差，电活性物质就被还原或氧化，在溶液和电极间发生电荷转移，形成法拉第电流。该电流经放大后，记录其随时间的变化即得电泳谱图。安培型电化学检测器分为薄层式、喷流式、圆筒式和探针式等类型。,安培检测示意图,CEEC检测模式,离柱,(off-column),柱端,(end-column),在柱,(on-capillary),3.1 检测模式,HPCE中通常使用的毛细管柱直径为2-100,m,，当内径大于25,m,时，由施加几十千伏的高压产生的通过毛细管内的电流比实际测得的电极上的法拉第电流高10,3,-10,6,。如何克服高电场对检测的干扰，是安培检测的关键。,In 1987,Ewing coupled the electrochemical detection with capillary electrophoresis,Off column detection,(A),Schematic of,coupled CZE,system:,A.,buffer,reservoir;B.,separation capillary;,C.,detection capillary;,D.,eluent.,(B),Detailed,schematic,of,porous,joint:,A,microscope slide:,B.,fused,silica capillary;C.porous glass capillary;,D.,joint:,E,epoxy;,F.,polymer coating,3.2 检测池与电泳系统的连接,End-column detection,Nafion制成的通道柱端安培检测示意图,PTFE管柱端安培检测示意图,3.3 微电极在,CEEC,中的应用,微电极是指直径在100,m,以下的电极，小于扩散层的厚度，与常规电极相比，伏安特性具有一些显著的特点。,i)微电极的表面电流小(pA-nA级)，iR降大大减小，使得电极可在低电导或无支持电解质的溶液中使用，拓宽了电化学研究的电位范围；,ii)电极具有大的面积/周长比，明显的边缘效应使传质速率增强，容易建立稳态传质，信噪比大大提高。,微电极种类很多，按其材料不同，可分为微铂、金、汞和碳电极；按其形状不同，可分为微盘极、微环、微球和组合式微电极等,碳纤维微电极的示意图(a)和横截面图b),10 mM Fe(CN),6,3-,+0.1 M KCl在碳纤维电极上的循环伏安图(5 mV/s),A-环氧树脂，,B-玻璃管，,C-铜丝引线，,D-碳粉，,E-毛细管，,F-碳纤维,碳电极,电化学发光法（ECL）目前已成为分析科学领域研究的热点。,ECL法主要用于物质含量的测定：,氨基酸，DNA,蛋白质，基因，免疫学,ECL,法,Ru(bpy),3,2+,ECL：,最令人感兴趣，研究和应用最多的ECL体系,Ru(bpy),3,2+,电化学发光的基本原理,优点,电极表面伴随氧化或还原反应时的发光过程,试剂可循环利用,灵敏度高,重现性好,动态范围宽,信号可视性,仪器装置简单,如何将高灵敏度的,ECL,检测与高分离效率的,CE,有机结合,？,新型,CE-ECL,检测池,采用细内径,(25,m),的毛细管,采用直径达,300,m,的,Pt,盘电极,柱端方式连接，不受电泳电流的影响,相对较大的工作电极使得安装方便,将Ru(bpy),3,2+,加入检测池，定期更换，,维持其浓度,New,新型,CE-ECL,检测池,工作电极与毛细管出口相正对，被分析物经电泳分离，从毛细管出口处泳出，被由工作电极原位激发的三联吡啶钌所氧化，在该过程中释放出光子，被光电倍增管检出作为我们的检测信号,第六章 高效毛细管电泳分离模式,separate types of HPCE,一、毛细管区带电泳(,CZE,),capillary zone electrophoresis,二、毛细管凝胶电泳(,CZE,),capillary gel electrophoresis,三、胶束电动毛细管色谱,micelle electrokinetic capillary electrophoresis,四、毛细管等电聚焦(,CIEF,),capillary isoelectric focusing,五、毛细管等速电泳,capillary isotachophoresis,分离类型,八种分离类型，介绍常用的几种；,根据试样性质不同，采用不同的分离类型；,每种机理的选择性不同；,毛细管区带电泳(CZE)亦称毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳中最基本也是应用最广的一种操作模式，通常把它看成其它各种操作模式的母体。它是基于分析物表面电荷密度的差别进行分离的。实验中，在毛细管和电解池中充以相同的缓冲液，样品用电迁移或流体动力学从毛细管一端导入，施加电压，样品离子在电场力驱动下以不同的泳动速度迁移至检测器端，形成不连续的移动区带分离出来,在CZE中，需要控制的主要操作变量是电压、缓冲液的pH和浓度、添加剂、进样电压和时间。同时，合理优化选择柱温、分离时间、柱尺寸、进样和检测体积、溶质吸附和样品浓度等也将大大提高柱效。CZE还可通过改变电渗流的方向来选择分析待测的离子。,一、毛细管区带电泳,capillary zone electrophoresis，CZE,一、毛细管区带电泳,capillary zone electrophoresis，CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。,正离子,：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；,中性粒子,：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子,：两种效应的运动方向相反；,电渗流,电泳,时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于,差速迁移,被相互分离。,最基本、应用广的分离模式；,Applications of CZE,Wide variety of applications,Small molecules,Macromolecules(proteins,peptides),Advantages,Simple,Direct analysis of complex systems,Limitations,Must have different charges,Low ionic strength sample,二、毛细管凝胶电泳,capillary gel electrophoresis，CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。,其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。,蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。,特点,：抗对流性好，散热性好，分离度极高。,无胶筛分技术,：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,MECC是Terabe在1984年首先提出的。最大优点是使毛细管电泳在用于离子型化合物分离的同时进行中性物质的分离，这样大大提高了CE分离生化物质的能力，具有广泛的应用前景。它是一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液相色谱。,三、胶束电动毛细管色谱,（MECC，MEKC）,micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC,将表面活性剂加入缓冲液中，当其浓度超过临界浓度时即可形成含有疏水性内核的胶束，因胶束相类似于色谱中的固定相称为“准固定相”。溶质在准固定相和流动相水相间分配，在水相中的迁移受电渗流的支配，而在胶束相中的迁移是电渗流和胶束电迁移共同作用的结果。不同物质根据其分配系数及电迁移淌度的不同而被分离。,1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,2.电泳流和电渗流的方向相反，且,电渗流,电泳,，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5.,色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；,4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围,；,机理,Schematic of MEEKC process,通常用作表面活性剂的化合物有四类，即阴离子、阳离子、两性离子和非离子表面活性剂，其对应的典型化合物为：十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基季胺溴(CTAB)、,N,-十二烷基-,N,N,-二甲基胺-3-丙烷-1-磺酸(Sulfobetaine)和聚氧化乙烯-23-十二烷基醚(Brij-35),Sodium dodecyl sulphate(SDS)is the most widely used emulsifier surfactant in MEKC.The oil droplet is coated with SDS surfactant molecules making the droplet negatively charged.The C,12,alkylchain of the surfactant penetrates into the oil droplet whilst the negatively charged hydrophilic sulphate groups resides in the surrounding aqueous phase.Charge repulsion of the negatively charged sulphate group on the SDS prevents highly efficient packing and prevents formation of an emulsion as the surface tension cannot be sufficiently reduced.A co-surfactant,usually a medium chain length alkyl alcohol such as butan-1-ol,is therefore essential in the formation and improved stability of the microemulsion.The co-surfactant bridges the oil and water interface and further reduces the surface tension of the system to zero.Figure 1 provides a schematic of the emulsion droplet showing the short chain alcohol,SDS,the octane droplet and the sodium ions surrounding the droplet.,分配系数,容量因子,t,0,t,mc,准固定相,优点：,MECC(MEKC),Two-part separation process,Electrophoretic mobility in free solution,Partitioning between micelle and solution,Micelles,Formed in aqueous solutions above,cmc,Ionic head group and hydrophobic core,Sodium,dodecyl,sulfate(SDS)is the most common choice,Factors Affecting Selectivity,Surfactant type,Different head groups give different,selectivities,(ionic interactions),Bile salts,Cationic surfactants(reverse flow direction),pH,Controls ionization,Buffer,Additives can have greater effect than in CZE,Organics generally bad,Temperature,Greatly changes micelle behavior,2,C can radically alter separation,1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；,2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6,8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；,3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,四、毛细管等电聚焦,capillary isoelectric focusing，CIEF,4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；,6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；,7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。,2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,五、毛细管等速电泳,capillary isotachophoresis，CITP,3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(,=,E,)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4,电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；,4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,capillary isotachophoresis，CITP,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定相，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；,六、毛细管电色谱,capillary electroosmostic chromatography，CEC,第七章 高效毛细管电泳应用与进展,application and advances of HPCE,一、,离子分析,analysis of ion,二、,药物分析,analysis of pharmaceutics,三、手性化合物分析,analysis of chiral compounds,四、氨基酸分析,analysis of amino acids,五、,核酸分析及DNA测序,analysis of nucleic acids and sequence of DNA,六、新进展及热点问题,advances and special topics,一、离子分析,analysis of ion,阳离子分析,迁移方向和电渗流方向一致；,4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；,具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；,质量小、电荷密度大的离子如：SO,4,-2,、Cl,-,、F,-,等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；,加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；,二、药物分析,analysis of pharmaceutics,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；,尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；,采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLC法,三、手性化合物分析,analysis of chiral compounds,合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；,R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；,HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；,形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；,常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,四、氨基酸与蛋白质分析,analysis of amino acids,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；,HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；,问题：吸附和检测；,蛋白质分析,五、核酸分析及DNA排序,analysis of nucleic acids and sequence,of DNA,重要分析手段；,图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,