无菌检查法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,无菌检查法,无菌检查的定义,无菌检查的环境,无菌检查的设备,无菌检查的人员,无菌检查的外部供应,无菌检查的样品管理,无菌检查的具体步骤,无菌检查的结果保证,2,无菌检查的定义,中国药典,2005,年版对无菌检查的定义是：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。,由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识即产品通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。,反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。,3,无菌检查的环境,中国药典,2005,年版对无菌检查环境的规定主要有：,无菌检查应该在洁净度为,10000,级，局部,100,级的单向流空气区域内或隔离系统内进行,无菌检查的全过程，应该遵守无菌操作，避免微生物污染，检查的环境应该能够提供这种保障,无菌检查的单向流空气区域、工作台面和环境应该定期验证,隔离系统应该按相关技术要求进行验证，内部洁净度应该符合无菌检查的要求,4,洁净室,一般应该具备核心操作区、缓冲区、更衣区、阳性对照操作区等区域,实验室应该根据洁净室的特点，制订并执行洁净室的使用、维护、验证标准操作规程,为避免交叉污染，无菌检查的洁净室宜单独设置，单独使用,洁净室的使用,在实验开始之前,1,小时启动风机系统（空调系统），并开启空气消毒装置，消毒至少半小时后关闭,观察并确保洁净室的压差,物品经物流通道进入洁净室,人员正确着装后经人流通道进入洁净室,使用完毕，应用消毒液清洁工作台面。实验人员在更衣室换下无菌工作衣后出洁净工作室。开启空气消毒装置，消毒至少半小时后，关闭洁净工作室的控制开关。,5,洁净室的维护,系统维护,过滤器的清洗更换：每月清洗净化空调系统的新风口和初效空气过滤器；每季度更换净化空调系统的中效过滤器；每年更换单向流区域的高效空气过滤器，并视洁净室验证结果，选择更换其他区域内的高效空气过滤器。,风机系统的维护：每半年检查送风风机和排风风机的各项指标，视情况更换风机涡轮轴承。,空调系统的维护：每年夏、冬两季之初，对空调机组进行维护，重点是压缩机保养、制冷剂补充和远程控制系统验证。,洁净室内压力梯度的维护：每半年调试洁净室内各区域间的压力梯度，确保正压房间对相邻房间有,5Pa,以上的正压，负压房间对相邻房间有,5Pa,以上的负压。,6,清洁维护,洁净室的清洁维护分为日常维护、定期维护和不符合时的维护。,日常维护由每次实验的实验人员进行，维护的范围为进行实验的洁净工作室和辅助洁净区，维护的频率为每次实验后。,定期维护由实验室指定专人进行，维护的范围为所有洁净工作室，维护的频率为每二周一次。,不符合时的维护由实验人员进行，维护的范围为所有不符合的洁净室，维护的时机为出现不符合时。,洁净室的验证,验证的项目：洁净度、微生物数、换气次数、静压差、照度、温度、相对湿度,7,验证的技术要求,8,验证的周期,建议每半年一次，也可根据洁净室的使用频率适当增加验证次数,验证的方法,洁净度和微生物数：采用,GB/T1629216294-1996,其他项目：参照,JGJ71,90,验证不符合项的处理,当洁净度、微生物数、换气次数、静压差等指标出现不符合时，应停用洁净室，对净化系统进行调整后，在重新验证，直至符合规定才能重新启用洁净室,当温度、相对湿度和照度等指标出现不符合时，洁净室可不必停用，但应及时修复空调系统（或更换照明装置），使其符合规定,9,无菌检查的设备,用于无菌检查的主要仪器设备有：超净工作台、集菌仪、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、隔水式恒温培养箱、生化培养箱、立式冷藏柜和生物显微镜等。,上述仪器设备中，温度设备应进行校准或验证，超净工作台和生物安全柜应进行性能确认。校准、验证和确认的频次通常为每年。,温度设备的校准：对培养箱、干热灭菌器等温度设备，应进行热分布和热均匀性等指标的检定；对湿热灭菌设备应检定安全阀、压力表等安全装置，同时应采用生物指示剂进行有效性确认。,超净工作台和生物安全柜的性能确认：应进行洁净度和微生物数的测定，生物安全柜还应该进行气流流型和压差测定。,10,无菌检查的人员,应由具备微生物学专业背景，并经过无菌操作培训的专业人员来从事无菌检查,从事无菌检查的专业人员除了应该具备专业技能外，还应该具有高度的责任心和严谨细致的工作作风,上岗培训应至少包括以下内容,无菌操作的基本技能,无菌操作环境的使用、维护、验证技能,仪器设备的使用和维护、验证技能,培养基的配制和质量控制技术,不同产品无菌检查的操作技能,无菌检查方法验证的技能,无菌检查结果判断的能力,无菌检查异常结果的分析处理能力,阳性对照菌种的使用和生物安全知识,11,无菌检查的外部供应,外部服务的采购,试剂、试药的采购,过滤系统的采购,其他物品的采购,12,外部服务的采购,电力供应,微生物检验能耗较高，确保电力的持续供应是保证实验正常开展和结果准确可靠的重要保障。为此，至少需要对下列设备提供备用电力供应。,微生物检验洁净室（区），包括送风风机、排风风机、空调和洁净室（区）内部的照明和插座用电以及高压蒸汽灭菌器。要求市电停止供应后，能够立即无缝切换至备用电力供应，保证设施环境和被灭菌物品的灭菌质量不被短暂停电破坏。,冰箱、冷柜、培养箱和干燥箱。要求市电停止供应后，应在,1,小时内提供备用电力供应，避免持续断电对温度控制的较大影响。,13,洁净室系统维护,前述洁净室的系统维护应采用合同约定的方式予以保障,试剂、试药的采购,培养基通常采用干粉培养基，应确定主要供应商和备用供应商，实验室应储备足够数量的干粉培养基,稀释级、冲洗剂如采用外购成品的方式，应确定主要的供应商，并建立采购物品的验收制度,过滤系统的采购,首选一次性使用全封闭过滤集菌器，应确定主要供应商和备用供应商，实验室应储备足够数量的过滤器，并建立验收制度,也可使用反复使用的过滤器，应确定滤膜的主要供应商，并对采购的滤膜进行验收,14,其他物品的采购,无菌检查还需要使用以下物品：试剂瓶及封口、消毒剂、脱脂棉花、消毒剂缸、无菌衣、一次性手套、口罩、剪刀、镊子、止血钳、酒精灯、一次性注射器、环境微生物采样器材和纯化水。,试剂瓶及封口主要用于配制盛装培养基，其径高比应符合规定。封口可以采用橡胶塞加铝盖轧口的方式，也可以采用纱布包裹的方式。,无菌衣采用可重复使用的无纺布面料的产品。每位检验人员应确保有,1,套新的无菌衣作为贮备。口罩、手套均为一次性用品，应确保有足够的数量。,消毒剂、脱脂棉花、消毒剂缸主要用于配制盛装消毒剂，应确保有足够的数量。常用的消毒剂有,75,乙醇、,1,苯扎溴铵溶液、,20,聚维酮碘溶液、,3,碘酒溶液和,5,石炭酸溶液。,环境微生物采样器材主要包括表面接触碟、拭子和,TSA,平板，应贮备足够数量的上述产品，并确保处于有效期内。,纯化水用于培养基和消毒剂配制，应保证有足够的数量。,其他物品均为实验室常用器材，应确保有足够的数量用于无菌检查。,15,无菌检查的样品管理,检验数量的确定,抽样,样品的贮存,检样的确定,检毕样品的处置,16,检验数量的确定,药品生产企业在进行产品的放行检验时，均应根据无菌检查法中表,1,的规定确定检验数量；药品检验机构在进行监督检验、委托检验时，应根据无菌检查法中表,2,、表,3,第,3,列的规定确定检验数量。,需要特别指出的是：,所确定的检验数量是最少量，意味着不能少于该数量，但允许多于该数量,表,1,的附注应正确理解。如：批产量大于,500,个的注射剂，按规定每种培养基的最少检验数量为,20,个包装，同时附注指出“若每个容器中的装量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量应加倍”，表明当这,20,个包装中的内容物足够分别接种两种培养基时，最少检验数量就是,20,个包装。,17,如何确定每个容器中的装量是否足够接种两种培养基呢？请看表,2,和表,3,的第,2,列。,如：供试品为注射液，装量为,1ml,，,按表,2,第,2,列的规定，每支样品接种每管培养基的最少样品量为全量，则对每支样品而言，其装量是不够接种两种培养基的，因此，对该规格的产品，其出厂检验最少检验数量应为,40,支。,以上确定的检验数量均不包括阳性对照实验的量，对于采用薄膜过滤法的实验而言，应再增加,1/2,的量，上例中，最终的一次检验用量应为,60,支；对于采用直接接种法的实验而言，应再增加,1,支，上例中，最终的一次检验用量应为,41,支。,18,抽样,样品的代表性越强，检验结果的可信度就越高,抽样数量：检验数量的,3,倍,药品生产企业的抽样,生产线抽样时：不同生产时段的产品均应涉及,仓库抽样时：不同包装箱的产品均应涉及,药品检验机构的抽样,一般监督检验的样品：尽可能涉及多个包装箱,问题产品：对被控制的所有产品均应开箱检查，通过外观检查尽可能发现有外观异常的样品，抽取作为检样,抽样的标识和记录,对于来自不同时段、部位的样品应有明显的标识以示区别,所有的抽样均应有详细的记录，主要记录被抽样品在抽样当时所处的状态,对于问题样品的抽样过程应有视频记录,19,关于无菌采样,对于无菌原料药的一种抽样方式,应有专用的场所，并在百级层流保护下进行,应由具备无菌操作技术的专业人员进行,应制订无菌采样的标准操作规程，规定抽样环境确认、人员进入、物品进入、开包装、取样、混样、分装、记录和样品标识等技术环节,如：抗生素无菌原料药的无菌采样,确定检验数量：,6,个容器，另加,3,个容器作为阳性对照,确定检验量：每个容器至少取,1g,确定是否需要分装：根据产品的溶解性能而定，如产品易溶于水，则不必分装，否则应分装,步骤：无菌打开每个容器，从中取出至少,1g,，,置无菌混样容器内；混匀；根据需要，分装至适宜的无菌玻瓶中，铝盖轧口。,20,样品的贮存,所有抽取的样品应尽快传递至实验室，在开检之前，应根据样品的贮藏要求，置适宜的场所贮存。,如：注射用头孢哌酮钠,标准规定：应置冷处保存；则在开检之前样品应放置在不高于,10,的环境中,药品检验机构对问题样品在开检之前除了在技术上保证样品的贮存条件符合标准规定外，还应该从证据保全的角度确保样品的安全,21,检样的确定,普通样品：根据随机的原则，从抽取的样品中，确定一次检验用量作为检样,问题样品：应优先使用外观异常的样品作为检样,检毕样品的处置,已破坏的检毕样品应根据实验室废弃物处置的规程处理,对于问题样品，应根据上级部门的要求，保存所有检毕样品，并确保其安全,22,无菌检查的具体步骤,实验准备,人流、物流程序,消毒剂配制,环境微生物的采集,检验方法的确认,检验过程,结果观察与判断,记录,23,实验准备,洁净室的启用,在检验开始前，应确保：,a.,洁净室净化空调系统持续运转不少于,1,小时，并能够持续工作；,b.,洁净室持续开启紫外光灯不少于半小时；,c.,洁净室中有压差要求的房间之间的压差达到规定，并能够持续保持。,d.,洁净室的更衣室内有新鲜制备的用于消毒双手的消毒剂。,在确认以上状态要求得到满足的情况下，可以启用洁净室。,24,培养基的准备,无菌检查至少需要准备以下培养基：液体硫乙醇酸盐培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基等。实验室应建立培养基配制的标准操作规程并按规程配制上述培养基。,液体硫乙醇酸盐培养基每瓶分装略大于,200ml,。,改良马丁培养基每瓶分装略大于,100ml,。,营养琼脂培养基应根据需要制备平板和斜面，主要用于环境微生物样本的分离鉴定。,营养肉汤培养基每支分装,10ml,，,用于菌种鉴定。,25,以上培养基按验证合格的灭菌程序灭菌。灭菌程序一般可选择,12120,分钟。在灭菌时应在灭菌器的上中下三层中分别放置留点温度计，并粘贴灭菌指示条。,灭菌结束后，应立即将所有培养基从灭菌器内取出，室温放置，自然冷却。营养琼脂斜面应趁热放置，平板应在洁净室内浇注。,无菌检查用培养基冷却后，应观察氧化层的高度，符合要求的，可用于无菌检查。,26,培养基的质量检查,无菌检查：取上述灭菌好的培养基各,5,个包装，分别置规定温度培养,14,天，培养结束后观察是否有菌生长。该检查可以与样品的检验同步进行，其结果作为样品检验结果判断的一个重要参照指标。,培养基灵敏度检查：,菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉,菌液制备：取上述菌种，分别制备浓菌液，稀释至,100cfu,以下，用于接种培养基。,接种：硫乙醇酸盐培养基每管,12ml,，,分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌，每种菌各两管培养基，另取,1,管作为空白对照；改良马丁培养基每管,9ml,，,分别接种白色念珠菌和黑曲霉，每种菌各两管培养基，另取,1,管作为空白对照。分别置规定温度培养,5,天，逐日观察结果。,频次：干粉培养基购入后，首次使用时，应进行灵敏度检查，以后当更换培养基批号、培养基配制方法和灭菌程序发生变化时需要重新做灵敏度检查。,27,实验器材、消耗品的准备,无菌检查至少需要使用以下器材和消耗品：,a.,无菌衣、平皿、消毒剂配制缸、脱脂棉花球、纯化水、剪刀、镊子、止血钳,b.,一次性使用集菌过滤器、一次性注射器、手套、口罩、环境微生物采集器材,c.,稀释剂、冲洗剂,d.,消毒剂、灯用酒精,28,其中,a,项在使用前应经过灭菌处理。灭菌方法根据器材的特点选择，无菌衣和脱脂棉花球、纯化水可采用湿热蒸汽灭菌，其他应选择干热灭菌法。干热灭菌不需放置留点温度计，但应粘贴灭菌指示条。,b,项为一次性使用物品。其中手套、口罩和一次性注射器均放置于洁净室内，实验开始后，可直接取用。集菌过滤器和环境微生物采集器材应根据实验需要，确定使用的型号和数量，并到器材暂存室领用。,c,项均为灭菌后的成品，应根据实验需要，确定使用的种类和数量。,d,项所指的消毒剂为浓溶液，如无水乙醇。应根据实验需要，确定领用的种类和数量。,29,人流、物流程序,物流,取塑料筐数个，内外表面均用适宜消毒剂消毒后（普通区使用的消毒剂），备用。从样品室取规定量的注射剂产品，用消毒剂消毒外包装后，放入塑料筐中。将灭菌好的物品从灭菌器内取出后，放入塑料筐中。取集菌过滤器、环境微生物采集器材、稀释剂、冲洗剂和洁净室内用消毒剂，消毒外表面后，放入塑料筐中。上述物品在控制区内转移入洁净室的传递窗内，其中样品需要脱去外包装。打开传递窗内的紫外灯，照射不少于,0.5,小时。,30,人员按下列程序进入洁净室,检验人员在物品紫外消毒即将结束时，开始进入洁净室。在更衣室脱去外衣和鞋。清洗双手后，在物品柜内取口罩和手套，戴上口罩。打开灭菌后的无菌衣外包装，取出无菌衣，穿戴整齐，要求严格覆盖头发、胡须和颈部。打开手套外包装，取出手套戴上，无菌衣袖口应包裹在手套内。,用更衣室内的消毒剂浸泡双手后，自然挥干。进入缓冲走廊，关闭传递窗内的紫外灯后，打开传递窗的门，取出样品和其他实验物品，置洁净室专用推车中，经二级缓冲，进入无菌操作间。,在正式开始实验前，应配制无菌操作间内使用的直接接触样品的消毒剂，并采集人员、物品表面的微生物样本。,31,消毒剂配制,根据消毒剂使用区域和对象的不同，将消毒剂分成,3,类，分别是：,第一类消毒剂，专用于普通实验区，仅用于物品外表面的消毒，常用的有聚维酮碘和石炭酸等；,第二类消毒剂，专用于洁净室的更衣室，仅用于佩戴手套的双手消毒，常用的有苯扎溴铵和,75,乙醇；,第三类消毒剂，专用于无菌操作间，直接用于消毒直接接触药品的容器表面，也用于实验操作过程中的手部消毒和实验台面消毒，常用的有聚维酮碘溶液和,75,乙醇。,32,第一类消毒剂的配制方法,不需使用无菌器具，可直接在普通实验区按消毒剂使用说明书的配制方法，用纯化水稀释消毒剂的浓溶液后使用。,第二类消毒剂的配制方法,不需使用无菌器具，应在更衣室内按消毒剂使用说明书的配制方法，用纯化水稀释消毒剂的浓溶液后使用。,第三类消毒剂的配制方法,需要使用无菌器具并在无菌操作间内配制。首先取一次性集菌过滤器一个，将排液口放置在灭菌过的锥形瓶上，将消毒剂浓溶液通过薄膜过滤的方式除菌。然后，按比例取灭菌后的纯化水，稀释浓溶液，制成可供使用的消毒剂。将此消毒剂倒入放置有无菌脱脂棉球的消毒剂缸中，得到可直接使用的消毒剂棉球。,该类消毒剂制备后，应收集消毒剂中的微生物。,33,环境微生物的采集,无菌检查操作过程中，人、物、空气和消毒剂中携带的微生物对检验结果的准确有重要的影响。按药典规定，在结果判断时，需要排除这些因素的干扰。因此，有必要收集这些环境中存在的微生物样本，为结果比较提供证据。以下规定的是收集这些实验室环境中微生物的操作方法。,34,人体表面微生物样本的采集：,采用接触碟按压方式采样。当人员进入无菌操作间，配制消毒剂完毕，并用消毒剂消毒双手后，取表面采样接触碟若干个，打开外盖后，分别在额头、颈部和胸部的无菌衣表面以及双手的大拇指和食指上按压采样。按压时间参照使用说明书的要求。采样完毕，关闭外盖，做好标记。采样结束后，应使用消毒剂清洁被采样表面。,35,物品表面微生物样本的采集：,采用拭子涂抹取样的方式采样。当人体表面微生物样本采集完毕后，取拭子，采集直接接触药品的包装容器表面和瓶塞、瓶盖等处的微生物样本，应选取不少于,3,个采样点；取拭子，对集菌过滤器、稀释剂、冲洗剂等外表面进行微生物采样，每种不少于,3,个采样点。拭子按使用说明书的要求立即释放微生物，并尽快加入培养基。采样完毕后，应使用消毒剂清洁被采样表面。,36,空气中微生物样本的采集：,采用浮游微生物采样器收集空气中的微生物样本。在进行其他环境微生物样本采集的同时，取营养琼脂平板或,TSA,平板，用浮游微生物采样器在无菌操作间回风口位置上，采集微生物样本。采样应不少于,2,点，每点的采样量为,1m,3,。,所有实验结束后，应重复在上述采样点的采样，要求同实验开始前。,消毒剂中携带的微生物样本的采集：,第三类消毒剂配制完毕后，可取适量，用薄膜过滤法处理后，取膜，贴在营养琼脂平板或,TSA,平板上。,37,所有采样标本均应在实验结束后，置,36,培养,48,小时，观察并保留出现的微生物菌落。,根据注射剂产品无菌检查的结果，确定是否需要对这些菌落开展进一步的分离鉴定工作。,如开展分离鉴定，则应采用,-70,低温冷冻保藏的方式，保藏上述样本中分离得到菌种的纯培养物。,38,检验方法的确认（无菌检查方法验证）,方法验证的基本概念：,1,、开展方法验证的必要性：确保无菌检查实验方法的有效。,2,、方法验证的对象主要有：无菌检查薄膜过滤法的验证、无菌检查直接接种法的验证,3,、方法验证的主要思路：加菌回收,4,、方法验证的时机：在建立一个产品的无菌检查方法时；当产品的组分或方法的参数发生改变时。,5,、方法验证实验可与供试品的无菌检查同时进行,39,方法验证的具体操作：,例,1,、薄膜过滤法无菌检查方法的验证,例,2,、直接接种法无菌检查方法的验证,40,例,1,、薄膜过滤法无菌检查方法的验证,一、目的,考察薄膜过滤法无菌检查的有效性，确定供试品的稀释浓度，冲洗剂的种类、用量和冲洗方式以及阳性对照菌,二、供试品,薄膜过滤法检验数量为,20,瓶，分别接种每种培养基。验证时的检验量应从全量开始。,41,三、菌种,无菌检查方法验证的菌种和培养基灵敏度实验的菌种相同，分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。,按药典提供的方法，分别用灭菌生理盐水稀释上述菌液，适宜的菌浓度为小于,100cfu/ml,。,42,四、培养基,提供培养基供应商、配制方法和配制日期等信息。,五、滤器,提供滤器供应商、滤器型号规格以及灭菌日期等信息。,六、稀释液和冲洗液,药典提供的冲洗液以,0.1,蛋白胨水溶液为首选。验证实验需要确定该溶液是否适用，如适用，还应确定用量和冲洗方式。,43,七、实验设计,1,、滤器：应至少准备,12,个滤器。,2,、供试品：应至少有,60,瓶的量。,3,、确定供试品溶液的浓度：将,10,瓶样品溶解在,500ml,适宜的稀释剂中，用待验证的方法过滤和冲洗，以抗菌谱中的最敏感菌为验证菌种（,1,种即可）或直接选择金黄色葡萄球菌，进行预试验,4,、冲洗液数量的设定：按梯次设定的方法，每个滤器冲洗液的过滤总量应分别按,300,、,500,和,1000ml,设定：亦可根据以往相同类别产品的验证经验，采用固定值设定，如统一为,500ml,。,5,、,冲洗方式的设定：主要是对蠕动泵的转速和冲洗次数进行设定。该项参数的设定可首先根据经验采用固定值，如过滤时泵速为,80rpm,，,500ml,冲洗液分为,50,、,50,、,100,、,100,、,100,、,100ml 6,次进行。,44,八、实验操作,1,、菌液的制备：略,2,、供试品溶液的制备：略,3,、过滤：取双联滤器一套，安装在底座上；取制备好的供试品溶液适量过滤。,4,、,冲洗：向两个滤器内泵入,50ml,冲洗液，调节泵速置设定值，在反复振摇中将冲洗液滤过，重复这个过程，直至每个滤器冲洗液的过滤总量接近设定值。,45,5,、菌种的加入：向冲洗液的残液中加入稀释至规定浓度的某一种菌液适量，使每个滤器接种的菌量为小于,100cfu,。,将接种有上述菌种的冲洗液残液通过上述滤器。,6,、培养基的加入：根据菌种的种类，选择适宜的培养基加入到上述滤器中。,7,、培养及结果判断：上述滤器置规定温度培养，,18,24,小时后，即可开始观察培养结果。若供试品管和空白对照管微生物的生长情况较为一致，则可以判断该供试品在上述实验方法下进行无菌检查是有效的；若供试品管微生物不生长或生长微弱，则表明上述实验方法无效，需要重新摸索各项实验参数，再重做验证。,8,、阳性对照菌的选择：可根据使用说明书中抗菌谱的敏感菌确定，也可根据实验结果选择最不容易生长的菌作为阳性对照菌。,46,九、验证的结论,1,、对观察到的实验结果进行评价，得出方法有效或无效的结论。,2,、对有效的方法，应将方法的具体细节详细表述，内容应大致包括：,1,）培养基的来源、制法以及配制日期,2,）供试品溶液的配制浓度,3,）冲洗液主要成分的来源、制法和配制日期,4,）过滤器的来源和型号,5,）供试品的检验量,6,）冲洗液的总量以及冲洗方式,7,）阳性对照菌,47,注射用泮托拉唑钠无菌检查方法验证结果,.doc,48,检验过程（以常用的薄膜过滤法为例）,取消毒剂棉球，消毒双手和集菌过滤器的外表面后，打开过滤器外包装，取出,3,联过滤器，将其固定在集菌仪底座上。,取冲洗剂,1,瓶，消毒外表面和瓶盖后，打开瓶盖，在酒精灯上烧灼灭菌后，在火焰附近打开过滤器的针头，插入冲洗剂瓶中。运行集菌仪，泵入少量冲洗剂（每个滤筒中约,25ml,）,润湿滤膜。（当供试品为油性样品时，该步骤可省略）,49,取规定量的供试品，仔细消毒外表面（和瓶盖、瓶塞）。在酒精灯火焰附近，打开供试品包装。如供试品为安瓿包装的液体制剂，则折断安瓿颈后，应立即将过滤器针头插入开口的容器中，迅速将药液过滤。如供试品为瓶装、袋装的液体制剂，则应在打开瓶盖后，将胶塞在火焰上烧灼灭菌后，插入过滤器针头，过滤药液。如供试品为粉针剂，则应首先溶解样品，再按液体制剂的操作方法过滤。注意，用于溶解样品的稀释剂不应用完，保留部分残液作为阴性对照样本的来源。,取冲洗剂，冲洗滤膜，用量根据方法验证实验确定。注意，使用的每瓶冲洗剂均不要用完，保留部分残液作为阴性对照样本的来源。,50,取培养基，去除瓶塞包裹物后，用消毒剂棉球消毒瓶塞后，经过火焰烧灼灭菌后，插入过滤器针头，分别向,3,个滤筒中泵入相应的培养基各,100ml,。,此时，两种培养基瓶中各还有部分残液，可妥善包扎瓶塞后，取出作为阴性对照样本。,另取,1,套过滤器，消毒外表面后，打开外包装，取出,3,联过滤器，固定在集菌仪的底座上。将上述残存的稀释剂、冲洗剂通过薄膜过滤，并泵入相应的培养基。培养基的操作方法按照前述的规定，保留部分作为阴性对照。,51,另取过滤器,3,套，消毒外表面后，分别打开外包装，分别泵入相应的培养基。培养基的操作方法按照前述的规定，保留部分作为阴性对照。,实验应设置阳性对照组。根据供试品的特点，选择正确的阳性对照菌。,所有灌注培养基的过滤器以及残存培养基的包装瓶，均应置规定温度培养。同时，取未开封的同批灭菌的培养基若干瓶，置相同温度培养，作为空白对照。,52,结果观察与判断,根据药典的要求，无菌检查的实验结果应逐日观察。每日的观察时间应基本一致。观察时，避免剧烈振摇。如样品干扰结果观察，应根据药典规定，在培养到期后，再转种培养。,转种培养,加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养,14,天后，不能从外观上判断有无微生物生长，则应进行转种,转种培养的方式：同种新鲜培养基接种或划线接种于斜面培养基上,转种培养时间：细菌,2,天、真菌,3,天,转种培养判断标准：同种培养基是否浑浊，斜面是否有菌生长；或涂片、染色、镜检,53,药典规定的结果判断原则,供试品管均澄清或虽显浑浊但经确认无菌生长，判供试品符合规定,供试品管显浑浊并确认有菌生长，判供试品不符合规定,在有证据表明下列情况属实时，在供试品管出现浑浊时，可判实验无效，允许重试,设备及环境监控结果不符合规定,无菌检查过程可能存在无所谓污染的可能,阴性对照有菌生长,供试品管中的无所谓经鉴定，确认是检验所用物品和（或）操作技术不当引起,重试若无菌生长，则判供试品符合规定，否则，为不符合规定。,54,对于观察中发现的供试品管出现的浑浊情况，应立即按下列方法处理：,a.,该供试品管结束培养。,b.,从该供试品管中，吸取,1,2ml,培养物，接种至相同的培养基中，继续在规定温度培养。,c.,取该培养物，低温冷冻保藏不少于,3,支冻存管。,d.,取该培养物，在,TSA,平板上划线接种，进行分离培养。,e.,若液体硫乙醇酸盐培养基管中出现浑浊，则取该培养物，划线接种至血琼脂平板上，厌氧培养，分离培养厌氧菌。,f.,对所有分离得到的菌落，应与阴性对照、空白对照可能出现的菌落以及实验室环境微生物样本的培养结果进行微生物相似性分析，并应将出现的菌落鉴定到种。,55,对无菌检查结果的判断可遵循下列原则：,a.,阳性对照管必须有菌生长，否则，应视为实验失败，应重新调整方法后，再进行实验。,b.,阴性对照、空白对照无菌生长，实验室收集的环境微生物样本培养后未见明显菌落，阳性对照有菌生长，供试品管培养基培养,14,天后未见浑浊，可判供试品无菌检查符合规定。,c.,供试品管培养基培养,14,天后未见浑浊，但阴性对照、空白对照中有菌生长，或者实验室收集的环境微生物样本培养后可见明显的菌落，阳性对照有菌生长，则可判供试品无菌检查符合规定，但应对阴性对照、空白对照进行微生物分离鉴定，并根据实验室收集的环境微生物样本的培养结果，通过相似性分析技术和菌种鉴定技术，来分析查找导致实验室污染的原因。,56,d.,供试品管培养基培养,14,天后，发现浑浊，阳性对照管有菌生长，则应分析阴性对照、空白对照的培养结果，并结合实验室收集的环境微生物样本的培养结果，在相似性分析的基础上，予以判断。当供试品管中的微生物与阴性对照、空白对照或环境中的微生物不相似时，应判该供试品不符合规定；当两者相似时，表明实验过程可能存在实验室污染的风险，本次实验结果不能成立应尽快重新实验。,f.,供试品管培养基培养,14,天后，发现浑浊，阳性对照管有菌生长，阴性对照、空白对照均未见有菌生长，同时实验室收集的所有环境微生物样本的培养结果均为未见有菌生长，则可直接判供试品不符合规定。,57,记录,培养基配制记录：包括使用的培养基名称、批号、配制方法、,pH,调整、分装体积、灭菌程序等。,灭菌记录：包括培养基灭菌记录、其他物品的灭菌记录，内容应至少包括灭菌程序、灭菌时间、留点温度计指示温度、粘帖灭菌指示条。,第三类消毒剂的配制记录：包括消毒剂的名称、批号、过滤除菌的滤器种类、批号、配制具体方法等。,58,环境微生物采样记录：包括接触碟、拭子的批号，厂牌，具体的采样方法，各采样点收集样本的培养结果等。,检验方法和检验过程的记录：详细描述检验的全过程，包括检验方法的确认、检验数量、冲洗剂和稀释剂的名称、批号等。,检验结果的观察和判断记录：包括逐日观察的结果、出现阳性样本后的处理方法、阳性对照的培养结果、阴性对照、空白对照的培养结果等。,相似性分析的记录：如果实行了相似性分析，需要提供菌种分离、纯培养、相似性分析的图谱等。如有必要，也可提供菌种鉴定的基本信息。,59,无菌检查结果保证的实验技术,环境微生物的采集技术,微生物相似性分析技术,菌种鉴定和溯源技术,60,环境微生物的采集技术,如前所述，主要包括表面微生物采样技术、空气微生物采样技术和液体微生物采样技术等,常用的仪器和器材主要有,接触碟、拭子,空气微生物采样器、培养基平皿,薄膜过滤器、滤膜,61,微生物相似性分析技术,形态学鉴定,染色镜检技术,生化鉴定技术,红外光谱分析技术,62,菌种鉴定和溯源技术,全自动微生物鉴定系统,基于基因分型的菌种溯源技术,63,全自动微生物鉴定系统,目的：判断供试品及控制样本中获得的微生物在分类学上属于那一种微生物，为正确判断污染的来源提供信息,手段：基于生化表型，商品化的生化实验试剂盒,范围：目前较好的鉴定系统能够准确鉴定,600,800,种常见微生物,主要仪器：生物梅里埃、,BD,、,德灵,64,有关无菌检查问题的答复,按药典规定，某些抗生素类药品无菌检查需要先将药液转移至,500ml0.9,无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理后，再依法检查。实际操作中是否可将药液直接过滤后，再用,500ml0.9,无菌氯化钠溶液冲洗，再依法检查。,不可以。实验表明，抗生素供试品的浓度对滤膜残留量有很大的正相关作用，因此适当降低过滤时的供试品浓度，能够显著减小滤膜残留量，从而减少冲洗剂的用量,65,有些高浓度产品再处理过程中会与缓冲液或培养基发生反应（也可能不是发生反应），或者处理过程无此异常，而在培养数天后有沉淀或结晶析出而影响判断，这种情况如何处理？,采用转种培养的方式,66,如何提高试验成功率？保证不染菌需注意哪些细节？,实验环境的消毒,培养基的无菌性,实验物品的消毒,直接接触样品的消毒剂的无菌保证,无菌操作技术,67,无抑菌性的注射剂做无菌检查的时候，可否不用冲洗液直接到滤膜,当该注射剂与培养基不会发生反应，或在培养基加入后影响结果观察时，可以这样操作,如存在上述情况，如乳剂、油剂等，则建议用少量冲洗液冲洗滤膜后再灌入培养基,68,如何使取样更具代表性，结果能完全代表该批产品,既然是抽样，就不要希望能够完全代表批产品,抽样的代表性是通过建立完备的抽样计划并严格遵照执行来实现的,如前所述，抽样计划应尽可能覆盖不同的生产时段以及不同的包装单位,69,检验操作过程中可能出现个别产品人为污染而其他产品不污染吗？如何控制这种现象产生？,完全有可能。对一次无菌检查而言，所有产品的包装都对最终结果有贡献，只要有一个出现异常情况，对最终结果而言，就不存在其他产品没有受到污染的情况了。,因此，无菌检查的无菌操作是始终必须高度关注的，它应该包括所有前述的操作要点。但是，并不能讲所有要点都关注到了，就不存在个别污染的情况了，微生物污染的风险是始终存在的，为此，才需要建立复杂的控制样本监控程序，帮助判断样品的实际污染情况,70,无菌检验中全封闭集菌器滤膜的耐冲洗量如何确定,根据,2010,年版中国药典的规定，总冲洗液用量应该不超过,1000ml,。,可以用完整性实验或生物挑战性实验来评价不同冲洗液量下，滤膜的通透性。,71,无菌检查中，若产品不合格，一般情况下，培养基几天时间内开始长菌出现浑浊？,如果产品为最终灭菌产品，且包装密闭性未破坏，则发生不合格时，一般会在,7,天甚至更后出现浑浊,如果上述条件无法满足，则任何时间出现浑浊都有可能,72,若操作完培养了,3,4,天就可以观察到出现混浊，跟至最后,12,13,天才观察到混浊的区别在于？或甚至到了第,14,天才出现，那么还需要继续培养观察吗？结果如何处理,不论什么时间出现浑浊，都应该按照出现浑浊的处理程序操作。,73,培养了,2-3,天就出现轻度混浊，一直至,14,天，其混浊度也不会加强，那么如何解释，是否会出现假阳性？,应按照转种培养处理，判断是否是微生物污染所致。如的确是微生物污染，则应根据出现浑浊并确认是微生物的处理程序操作。,74,对于有抑菌性的产品，冲洗液大概用多少量的范围较适宜,对于抗生素产品，一般情况下，冲洗液用量以每膜,300,500ml,为宜，具体应根据验证实验确定,对于一般有抑菌性的产品，冲洗液用量以每膜,100,300ml,为宜，具体应根据验证实验确定,75,谢 谢,76,