第7章-放射免疫技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,标记,免疫技术,=,抗原抗体反应,示踪物标记,灵敏性,特异性,标记免疫技术的主要特点：,高特异性、高灵敏性,免疫技术,+,标记技术,免疫技术：,以抗原,-,抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。,标记技术：,将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。,标记免疫分析,：,是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。,标记免疫技术基本,概念,标记免疫技术,免疫测定技术,免疫组化技术,示踪物及,标记技术,放射免疫技术,荧光免疫技术,酶免疫技术,化学发光技术,金免疫技术,二、放射免疫技术常用的放射性核素,125,I,3,H,射线 ,理化性 活泼 差,核素丰度 90%,半衰期 60.2d 12.3y,标记方法 简单 复杂,标记设备 低廉 昂贵,测量条件 简单 复杂,常用标记核素,125碘-标记物的制备标记,125,I,-,化学或酶促反应，将,放射性负电碘离子氧,化成碘原子或正电碘,离子，通过取代反应,置换被标记物分子中,酪氨酸或酪胺残基以,及组胺残基上的氢原,原子。,125,I或,125,I,+,125,I-标记物,（混合物）,Ch-T、LPO氧化,取代反应,直接标记法,三、放射免疫技术标记物制备及鉴定,使用无还原剂的高比放射性碘源,被标记物用量要少,ch,-T,用量要低,控制总反应体积,200l,反应时间,1-2,分钟,弱碱性反应条件,间接标记法,联接标记(,bolton-Hunter,)预先将,125,I用,ch-T,法标记琥珀酰胺酯，制成的,125,I 化酯功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。,bolton-Hunter,125碘-标记物的制备纯化,凝胶过滤法,离子交换层,析法,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,高效液相色,谱法,聚合、损伤物,标记蛋白,游离,125,I,125碘-标记物的制备鉴定,标记物质量,高比放射性,高纯度,完整免疫活性,放射化学纯度,单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率,应大于,95%,免疫活性,标记物与抗体结合的能力,标记物与过量抗体反应百分比,该值越大,标记物免疫活性好,比放射,单位化学量标记物中所含的放射性强度,单位：,Ci/g,mCi,/mg,Ci/mmol,比放射性过高，将影响标记物免疫活性,计算法：,依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性,.,自身置换法,：比较标记抗,原与标准抗原的免疫活性来,测定标记物的比放射性,结果准，测定复杂,四、放射免疫技术抗血清鉴定,抗体分子上一个抗原结合部,位与相应的抗原决定簇之间的,结合强度,用亲和常数,Ka,表示。,单位为稀度单位（,LM,-1,）,Ka,值高（,10,9,12,L/mol,）有助于提高灵敏度、精确度和准确度,亲和性,亲合力高,亲合力低,放射免疫技术抗血清鉴定,特异性,:,指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力,交叉反应率：,将反应的最大结合率抑制下降,50%,时特异性抗原与类似物的剂量（,ED50,）之比,抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性,特异性,效价,反映抗血清中有效抗体含量的相对参数，即抗血清稀释至能与抗原发生有效反应的最大稀释度。,效价,:,结合,50%,标记抗原时，抗血清的稀释度,五、方法学评价,除了常规的灵敏度、精密度、准确性、,特异性和稳定性之外，应注意以下指标：,可靠性：评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。,剂量,-,反应曲线高剂量钩状效应：当标本中被测物的浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。,第二,节,放射免疫分析,一、放射免疫分析基本原理,竞争性结合反应的经,典标记抗原（,Ag*,）和,非标记抗原（,Ag,）与限,量抗体,(,Ab,),竞争性结合,Ag*,和,Ag,具有等同的,与,Ab,结合能力,抗原抗体反应须满足以下条件：,1.Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质；,2.所加入Ag*和Ab的量应是固定的；,3.Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点；,4.Ag*、Ag及Ab须处在同一反应体系中。,B代表结合的标记抗原；,F代表游离的标记抗原；,T代表总的标记抗原。,B/T F/T,以未结合的Ag*为,F，Ag*Ab复合物,为B，则B/F或,B/(BF)与Ag的,量变存在着函数,关系剂量反应,曲线,注：T即是B与F的总和,二、放射免疫分析实验方法及测定,抗原抗体反应,Ag*,Ag,反应条件,体积,温度,时间,pH,Ab,(标准Ag/样品Ag),平衡,非平衡,一步法,二步法,分离结合、游离标记物,第二抗体沉淀法,PEG 沉淀法,PR 试剂法,活性炭吸附法,分离彻底，迅速,分离试剂和过程不影响反应平衡,效果不受反应介质影响,操作应简单、重复性好,经济,测量、数据处理,晶体闪烁计数器,包括了,NaI,闪烁晶,体、光电倍增管,以及计数器,测量的放射性信,号是仪器输出的,电脉冲数：每分,钟计数,(,cpm,),计算,参数,cpm,B/T (%),F/T (%),B/F (%),B/B,0,(%),拟合,注：T即是B与F的总和,第三,节,免疫放射分析,一、免疫放射分析基本原理,以过量,125,I标记抗体与待测抗原进行非竞争,性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F,进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA,操作也较RIA简单。,单位点 IRMA,先用,过量标记抗体,与,待测抗原进行反应，形成,抗原抗体复合物；用,固相,抗原,结合未结合标记抗体,并将其分离,测定,上清液,的放射量,双位点 IRMA,先用,固相抗体,与抗原结,合，再用,过量的标记,抗体,与抗原的另一决定簇结合，形成,固相抗体-,抗原-标记抗体,复合物，,洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。,二、IRMA与RIA比较,放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代,。,放射免疫分析技术的应用,重点,名词：标记免疫分析,1.放射性标记物制备方法,2.RIA和IRMA的原理及区别,3.如何分离结合与游离标记物？,1.放射免疫技术的核心是什么？,2.制备放射性,125,I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？,3.评价,125,I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？,5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？,6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？,7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？,8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？,9.闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？,10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？,思考题,选择题,放射免疫分析反应时，以下哪种情况是正确的（）,A.Ag和Ag*具有等同的与Ab结合的能力,B.Ag*为限量，且Ag的分子数多于Ag*，故竞争抑制Ag*与Ab的结合,C.Ag*Ab复合物的形成与Ag的量成正比,D.反应结束时，测定AgAb，即可确定待测抗原的含量,E.Ag*不限量，且Ag的分子数多于Ag*，故竞争抑制Ag*与Ab的结合,