第一章分离技术绪论.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第一章 绪论,目的与要求,1、掌握离子交换分离技术、凝胶分离技术、色谱分离技术、电泳技术、亲和分离技术、分子印迹分离技术等的基本原理及其特点。,2、能在实际工作中掌握几种分离技术的工艺过程及熟悉相关设备。,3、能在生物产品产业化研究及工艺设计中合理应用相应分离技术。,主要内容,1、绪论,2、离子交换分离技术,3、,凝胶分离技术,4、色谱分离技术,5、电泳技术,6、亲和分离技术,7、分子印迹分离技术,参考书,严希康.生化分离工程.化学工业出版社,孙彦.生物分离工程.化学工业出版社,毛忠贵.生物工业下游技术.中国轻工业出版社,曹学君.现代生物分离工程.华东理工大学出版社,邱玉华.生物分离与纯化技术.化学工业出版社,J CHROMATOG A,J MEMBRANE SCI,J SUPERCRIT FLUID,ENZYME MICROB TECH,CHEM ENG SCI,SEP PURIF TECHNOL,BIOCHEM ENG J,DESALINATION,SEPAR PURIF REV,SEPAR SCI TECHNOL,BIOSEPARATION,一、生化分离技术的研究对象,生化分离：是指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。,生化分离技术生化分离过程中所涉及到的技术。又称生物工程下游技术。,生物产品的一个主要特点：种类繁多（分离方法的多样性）,按用途分类,食品与精细化学品：食品添加剂（果葡糖浆、维生素）、化妆品（透明质酸）,医用类产品：疫苗、抗生素、重组医用蛋白等,农业用产品：兽用抗生素、生物农药、饲料等,生物试剂类,其他生物产品（生物柴油、生物材料PHB）等,按分子量大小分类,MW 1000Da：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质、核酸类,按目的产物所在的位置分类,胞内产品：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质,胞外产品：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等,细胞产品：酵母、单细胞蛋白,生物产品来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物等,二、生化分离技术的原理,有效识别混合物中,不同组分,间,物理、化学和生物学性质的差异,，利用能够,识别,这些差异的分离介质或,扩大,这些差异的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。,实现分离的本质：不同物质性质差异,物理性质：,(1),分子形状、大小 包括密度、几何尺寸和形状。,(2),溶解度、挥发性,(3),分子极性即电荷性质 包括溶质的电荷特性、电荷分布、等电点等。,(4),流动性 包括黏度、在特定溶液中的扩散系数等。,化学性质,(1)分子间的相互作用 包括分子间的范德华力、氢键、离子间的静电引力及疏水作用大小等。,(2)分子识别 即通过目的产物与某些分离纯化介质上的活性中心、基团进行的专一性结合。,(3)化学反应,pH6.3 加酸 pH2.4,谷氨酸锌离子 谷氨酸锌沉淀 溶液 谷氨,酸结晶,15,生物学性质：,主要是指生物大分子之间的分子识别和特异性结合。,三、生化分离技术的重要性,在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的50以上；,在产品的成本构成中，分离与纯化部分占总成本的4080；精细、药用产品的比例更高达7090。,显然开发新的分离和纯化工艺是提高经济效益或减少投资的重要途径。,生化分离是生物技术产品产业化的必经之路，故而越来越受到人们的重视。,四、生化分离的特点,生物技术产品以,粗料发酵,为主，粗原料增加了下游操作成本，包括发酵废液的处理成本，其中清液（精料）发酵将是一个方向。,目前发酵或培养大多是,分批,操作，各批发酵液产物浓度和其他物性会出现差异，实际生产中也会出现染菌的发酵液，因而需要技术的适应面宽，操作弹性大。,生物活性物质产品的,稳定性,制约了下游技术的可选范围。,发酵液放罐后，应及时快速操作：,菌体也可能自溶,容易被杂菌污染,引起产物的破坏和降解,，如原料液中常存在降解,目标产物的,杂质,，如可水解目标蛋白质的蛋白酶。,因此要求采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。,原料液中目标产物的浓度一般都很低。如 L-异亮氨酸为2.4，青霉素为3.6，庆大霉素为0.2，胰岛素仅为0.001。(见后页),原料液中常存在与目标分子结构极其相似的分子及异构体。,当生物技术产品是食品或药物时，溶剂的使用受到一定的限制，萃取、色谱、膜分离会受到一定的限制。,几种典型发酵液组分含量,一般情况下，,原料中产品浓度越低，下游技术的成本越高。,下游技术的步骤越多，总收率也越低,：,(90),6,53.1,(95),6,73.5,(95),64,3.75,重复提取,是提高总收率的一个有效方法。如谷氨酸一步等电点结晶，结晶母液如再经过一次离子交换提取：,75（1 75）65 91.25。,生化分离技术的选择原则,(1),采用步骤数最少,不仅生物过程，对于所有的分离纯化流程，都是多步骤组合完成的，但应尽可能采用最少步骤。几个步骤组合的策略，不仅影响到产品的回收率，而且会影响到投资大小与操作成本。,(2),采用步骤的次序要相对合理,在生物分离过程中，对于不同性质的产品，可以选用不同的单元操作，如果将其使用的次序进行合理的编排，可能会对整个分离过程有重要的影响，能够简化操作过程并提高产品的收率。,五、生化分离的一般工艺流程,六、分离效率的评价,1、分离方法和设备角度,分离容量（capacity）：单位体积分离设备处理料液或目的产物的体积或质量,分离速度（speed）：单批次分离所需的时间，或分离过程的进料速度,分辩率（resolution）：目标产品的纯化效果或杂质的去除能力,2、分离过程和产品角度,评价一个分离过程的效率主要有三个标准，即,目标产品的浓缩程度、分离纯化程度和回收率。,浓缩程度一般用,浓缩率,(concentration factor)表示，,是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标,。下图表示一个连续稳态的分离过程，其中,F表示流速,c表示浓度,；下标,T和X分别表示目标产物和杂质,。C、P和W分别表示原料、产品和废料。此时，浓缩率m 为：,目标产物的分离纯化程度用分离因子,(separation factor)表达，即,分离因子又称,分离系数,。上式表明，产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低、则分离因子越大，分离效率越高。,1,时末产生分离。因此，以分离为目的时，值应足够大，以期达到高效分离的目的。这时，浓缩率的大小往往成为次要的。,无论是以浓缩还是以分离为目的，目标产物均应以较大的比例回收，即有较高的回收率。图中目标产物的回收率为,生物分离操作多为间歇过程(分批操作)，若原料液和产品溶液的体积分别为Vc和Vp，则回收率为,对于具有生物活性的蛋白质类产物，往往用,分离前后目标产物的比活A之比,表示目标产物的分离纯化程度,比活A的单位一般为U/mg(U为生物活性单位)，此时的通常称作,纯化因子,(purification factor)。,七、生化分离技术的发展,1、历史沿革,（1）古代酿造业,如果将生物技术定义为“直接,或间接地利用生物体的机能来生产,人类所需产品的技术”，生物技术,产业的历史可以追溯到古代的酿造,业（公元前4228年），它包括酿造、,做面包、干酪、酸奶等。,但是古代的生物技术比较原始粗糙，一般都是家庭作坊式的生产，大多数产物基本不经过分离而直接使用，因此也就没有专门的生物分离技术了。,（2）原始分离纯化时期（第一代生物技术产品）,第一代（传统）生物工业是指,1860年代到1940年代青霉素等抗生,素出现之前的生物技术产业。这一,时期，发现了发酵的本质是微生物,的作用，而且发现了微生物的有关,功能，掌握了纯种培养技术，生物,技术进入近代酿造产业的发展阶段。,到20世纪上半叶，近代酿造产业的,生产技术已经有了很大的发展，又,逐渐开发形成了发酵法生产酒精、,丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌,氧发酵）。,这个时期的生化产品相对比较简单，基本上是无活性的小分子（有机溶剂）。此时开始引入化学工程中较成熟的近代分离技术，如过滤、蒸馏、精馏等，生产多以经验为主。,（3）传统分离纯化方法推广使用时期(传统第二代生物技术产品),20世纪40年代出现的青霉素产品的出现是生物技术发展史上的里程碑，也是第二代生物技术的代表。这一时期，随着无菌空气制备技术和大型好氧发酵装置的成功开发，微生物发酵工业迅速壮大，一大批（好氧发酵）的产品相继投入了工业化生产，如链霉素等抗生素、谷氨酸等氨基酸、核酸（核苷酸）、柠檬酸等有机酸、淀粉酶等酶制剂、微生物多糖和单细胞蛋白等。,产品的多样性对分离方法提出了更高的要求，许多化学工程工作者加入了生物反应过程的行列中，一门反映生物与化工相交叉的学科生化工程也于40年代诞生，并得到迅速发展。这期间借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，约有80的化工单元操作技术被引入生物工业。在60年代以前，生物技术产品的下游加工过程基本是套用化工单元操作或经过简单改造。这期间也产生了一些新的生化分离技术，但都还处于实验室研究阶段。,（4）快速发展时期(第三代生物技术产品),20世纪70年代中期以来，随着基因工程、酶工程、细胞工程、微生物工程以及生化工程的迅速发展，特别是DNA重组技术及细胞融合技术等技术取得的重大突破，一般认为以DNA重组技术及细胞融合技术为代表,确定了第三代生物技术（现代生物技术）的地位,促使了大量现代生物技术产品（如乙肝疫苗、干扰素等重组蛋白）的研究和开发。,此时生物技术在其各个主要领域都取得了长足进步，一大批对人类十分有益的高附加值的产品开始面世。80年代，国际上又兴起了对人类健康有益的生理“功能因子”的研究，发现了一大批生理功能性物质并推出了相应的产品，如低聚糖、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。,与此同时，人们注意到了下游分离技术对发展现代生物技术及其产业化的重要性，分离技术的落后会严重阻碍生物技术的发展。国内外纷纷加强对生物分离技术的研究力量，增设研究机构和加大资金投入，一些公司和生产企业也在生物分离技术领域展开竞争。,2、发展趋势,（1）,传统分离技术的提高和完善,蒸馏、蒸发、过滤、离心、结晶和离子交换等传统技术由于应用面广且相对成熟，对它们的提高和完善将会推动大范围的技术进步。,各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，也从一个侧面推动生物工业向更大规模方向发展。,适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面会更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。,（2）新技术的研究和开发,新型分离介质的研究开发：,如琼脂糖凝胶作为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质，开发出一大类各具特色的，对分离生物大分子十分有效的色谱分离技术。,子代分离技术：各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成了所谓融合技术或子代分离技术。,其他新兴下游技术：由溶剂萃取技术衍生出一大批生化分离技术，如菌体絮凝技术、菌体细胞破碎、超临界CO2萃取、反胶团萃取、液膜分离、电泳分离、磁性亲和分离、聚焦色谱、径向流色谱、连续环状色谱、,高速逆流色谱、,拟移动床色谱等。,（3）下游工程与上游工程相结合,发酵与分离耦合过程的研究：,这一新的技术思路在70年代首先用于厌氧发酵乙醇发酵过程中，取得了令人满意的效果，近年来逐步发展到用于好氧发酵过程中来。,发酵-分离耦合过程的优点是可以解除终产物的反馈抑制效应，同时简化产物提取过程，缩短生产周期，收到一举数得的效果。,将原来是胞内产物的蛋白质，通过连接信号肽被细胞分泌到胞外，省去了细胞破碎的过程，从而使得分离工作变得简单。,将噬菌体裂解基因转入重组菌，可以在很温和的条件下将菌体细胞破裂，大大降低细胞破碎的成本。,利用基因工程方法，在构建的融合蛋白质上接上6个组氨酸（6His tag），使其能被亲和吸附组氨酸的介质一步分离并纯化。,（4）强化化学作用对下游工程的影响,一是选择适当的分离剂，增大分离因子，增加对某一组分的选择性。,二是向分离体系投入附加组分，改变原来体系的化学位，从而增大分离因子，如手性物质的分离。,强化化学作用对相界面传质速率的影响：利用一些相转移促进剂来增大相间的传质速率。如亲和色谱、亲和吸附、亲和过滤、亲和膜分离等。,（5）改进上游因素，简化下游过程,培养基和发酵条件；,代谢工程：一般以开发新物种和提高目的产物量为目标，现在应该转变观念，从整体出发，除了达到以上目标外，还应设法增加产物的胞外分泌量，减少非目的产物的分泌（如色素、毒素、降解酶及其他干扰性杂质等）以及赋于菌种或产物以某种有益的性质以改善产物的分离特性，从而简化下游加工过程。,思考你所接触过的分离技术,