食品微生物学基础实验之二微生物染色技术1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、目的和要求,1、掌握细菌涂片和染色的基本技术,2、了解革兰氏染色的机理、掌握革兰氏染,色的方法,3、掌握细菌芽孢的染色方法,4、掌握无菌操作技术,5、学会使用普通生物显微镜,二、实验原理,1、细菌细胞微小且无色透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色剂使菌体着色，增加与背景的反差，才能在显微镜下观察菌体的个体形态和部分结构。,因此，微生物染色是微生物学中的一项基本技术。染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而会有不同的染色反应。在一般情况下细菌菌体多带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其它染料一样是一种盐，电离后染料离子带正电，易与带负电的细菌结合而使细菌着色。生物染色常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、石炭酸复红、番红等。,（1）简单染色实验原理,2、简单染色法：是只用一种染色剂对细胞进行染色。此法操作简便，适用于菌体的一般形态观察，但通常不能显示细胞构造，也不能鉴别细菌类别。染色前必须将菌体涂布于载玻片上并进行固定，其目的是杀死细菌，并使菌体粘附在载玻片上，防止菌体被染色剂冲掉。此外还可增加菌体对染料的亲和力。,三、实验材料及仪器,(一)菌种,枯草芽孢杆菌(,Bacillus subtilis,),大肠埃希氏菌(,Escherichia coli,),金黄色葡萄球菌(,Staphylococcus aureus,),(二)试剂,革兰氏染色液、（草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95乙醇、番红染色液）、孔雀石绿染液。,(三)其它,显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，香柏油，二甲苯，擦镜纸等。,四、方法与步骤,(一)制备涂片,(1)涂片：取洁净无油载玻片一块，在其中央滴加一小滴无菌水，用接种环以无菌操作法从试管斜面取少许细菌培养物，在载玻片上的水滴中研开后涂成薄的菌膜(直径约1cm)。如是液体标本，直接用接种环挑取12环菌液，涂布于玻片上，制成薄的菌膜。,(2)干燥：将涂布的标本在室温中自然干燥。如需加速干燥，可在酒精灯火焰上方的热蒸汽中加温干燥，但切勿在火焰上直接烘烤。,(3)固定：手执玻片一端，涂有菌膜的一面朝上，以其背面迅速通过火焰23次，略作加热，以玻片背面触及手背皮肤，以有热感但不觉烫为度。,(二)染色,1、革兰氏染色,(1)初染：在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色约11.5min，然后用细小的水流从标本上端冲净残余染液(注意勿使水流直接冲洗涂菌处)，至流下的水无色为止。,(2)媒染：滴加路哥氏碘液覆盖菌膜，媒染约11.5min，然后用流水冲洗掉多余的碘液。用吸水纸吸干载片上的水分。,(3)脱色：倾斜玻片并衬以白色背景，流滴95乙醇冲洗涂片，同时轻轻摇动载片使乙醇分布均匀，至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止脱色，并立即用水冲净乙醇。,(4)复染：滴加番红染液，染色12min，水洗后用滤纸吸干水分。,革兰氏染色,2、芽孢染色,(1)用培养24h左右的斜面菌种作涂片、干燥、固定、加滤纸。,(2)滴加35滴孔雀石绿染液于固定好的涂片上至滤纸饱和。,(3)用试管夹夹住载玻片，在火焰上方徐徐加热，保持染液冒蒸汽而不沸腾，切勿使染液蒸干，必要时应添加少许染液。从染液蒸汽开始计时，加热45min。,(4)倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止,(5)用番红水溶液复染1min，水洗。,(6)待干燥后，置油镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色,芽孢染色,五、实验内容,（1）将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别做革兰氏染色。,（2）制备大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，并做革兰氏染色，以进行对比。,（3）制备枯草芽孢杆菌涂片，做芽孢染色。,（二）、光学生物显微镜的使用,一、目的和要求,由于微生物的个体小，必须借助于显微镜将其放大才能看清楚它们的形态，所以显微镜的使用是微生物学的基本操作，必须认真掌握。,1了解普通生物显微镜的构造和性能,2正确掌握显微镜的使用技术和保养方法,二、实验材料及仪器,(一)标本片,自己制作的细菌涂片,(二)仪器和药品,普通光学生物显微镜、镜头纸、香柏油、二甲苯等。,三、实验内容,显微镜的构造,普通光学生物显微镜由机械系统和光学系统组成,。,接目镜,镜筒,物镜转换器,接物镜,载物台,聚光器,镜臂,粗调螺旋,细调螺旋,镜座,光源,电源开关,光源调节器,玻片推进器,虑光片,虹彩光圈,四、显微镜的保养,显微镜是精密贵重的仪器，须很好地保养。使用时应注意下列事项。,(1)显微镜不能随便拆卸，各透镜应用镜头纸擦拭不得以手沾抹或用其它纸、布等擦拭，以免破坏镜头，沾上手印。,(2)勿将显微镜与酸、碱及挥发性药品放在一起。,(3)避免阳光暴晒，以免在高温下柏胶溶解或变形，使透镜脱落。,(4)显微镜应存放在干燥地点，雨季应在箱内放置硅胶以吸收水分。,五、作业,1、按照显微镜的使用方法，观察自己制作的细菌染色涂片。,2、绘制油浸镜下所观察到的细菌形态,并注明菌名并注明放大倍数。,六、思考题,1、显微镜在使用时和使用后要注意哪些问题？,2、为什么使用油镜时要加一滴香柏油?,革兰氏染色图片,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,大肠和金葡菌,芽孢和鞭毛菌染色,芽孢菌染色片,鞭毛菌染色片,谢 谢,2012年03月,