核酸的光谱学和热力学特性.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,要点,核酸的紫外光吸收,DNA的纯度,核酸定量,减色效应和增色效应,热变性及复性,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶,(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),核酸的紫外吸收,嘌呤环和嘧啶环中含有共轭双键，因而都有吸收紫外光的性质，吸收高峰在波长260nm左右。,减色效应,单一核苷酸RNA和ssDNAdsDNA,这种dsDNA相对于ssDNA吸收值减少的现象就成为减色效应。,dsDNA吸收值之所以最少，是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的。,在研究核酸、核苷酸、核苷及碱基时，可以此对核酸进行定性及定量分析。另外，紫外线照射可引起DNA突变，也是由于存在于DNA中的核苷酸吸收紫外光所造成的。,OD,260,的应用:核酸定量,1.DNA或RNA的定量,OD260=1.0,相当于,50,g/ml双链DNA,40,g/ml单链DNA（或RNA）,20,g/ml寡核苷酸,2.判断核酸样品的纯度,DNA纯品:,OD260/OD280=1.8,RNA纯品:,OD260/OD280=2.0,核酸定量,在研究核酸、核苷酸、核苷及碱基时，可以此对核酸进行定性及定量分析。,DNA纯度,dsDNA的A,260,/A,280,=1.8,RNA的A,260,/A,280,=2.0,蛋白质的最大吸收峰为280nm,如果A,260,/A,280,1.8,说明有RNA污染。,如果A,260,/A,280,1.8，说明有蛋白质污染。,溶解性：,RNA和DNA是极性的化合物都微溶于水不溶于乙醇乙醚、氯仿等有机溶剂。,在生物细胞内都与蛋白质结合成,核蛋白,。DNA核蛋白(DNP)与RNA核蛋白(RNP)的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。,DNP溶于水和浓盐溶液，在1mol/L的NaCl溶液中溶解度比纯水高2倍，但在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低仅为水的1%，几乎不溶解；,RNP在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，,在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。,核酸的热变性与复性,变性（denaturation）,核酸的变性是指核酸的互补配对碱基之间的氢键断裂，而构成磷酸-戊糖骨架的3,5-磷酸二酯键并未发生变化。,温度升高，溶液的盐浓度降低，或者溶液的酸碱度改变，都可以使核酸发生变性。实验室中最常用的使DNA分子变性的方法之一是加热。DNA分子的变性可以导致,A,260,增加。,变性引起紫外吸收值的改变,DNA,的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD,260,增高的现象。,RNA随温度升高碱基堆积会逐渐减少，光吸收值会逐渐地、不规则地增大。,dsDNA升温过程中，分子末端及内部富含A-T的区域的变性将会使其附近的螺旋变得不稳定，从而导致整个分子结构在一个确定的温度共同变性，这一温度取过渡期的中点值，称为解链温度（melting temperature），以,T,m表示。,T,m值计算公式为：,T,m69.3+41(G+C)%少于20个碱基的寡核苷酸的,T,m4(G+C)+2(A+T),DNA的复性,DNA复性(renaturation)的定义,在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,DNA复性时，其溶液OD,260,降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。,这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交,。,核酸分子杂交(hybridization),与探针的杂交,讨论题,A同学做基因表达谱分析实验时从大豆的根中提取RNA样品，,她将纯化的RNA样品溶解在20,l的DEPC处理水中，然后取,2l加480l纯水使总体积达到500l，再转移到比色杯中，,用紫外分光光度计测,RNA样品的,浓度并考察该样品的纯度，,她测定的数据如下图所示。请你根据这些数据说明如何计算该,样品RNA的浓度并帮她计算该样品RNA的浓度同时判断该样品的,纯度是否达到实验的要求。如果这是一个DNA样品，那么该样品,的DNA浓度如何计算，你算出的DNA浓度是多少，其纯度如何？,