1.2基因工程的基本操作程序.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,实施基因工程第一步,目前常用的方法有,:,1,、从,自然界,已有的物种中分离,2,、用,人工,方法合成,目的基因的获取,目的基因,:,主要指,编码蛋白质,的结构基因。,也可以是一些具有调控作用的因子。,1.2,基因工程的基本操作程序,原核,细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,(,编码区上游,),(,编码区下游,),与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区,非编码区,不编码蛋白质，有调控作用,编码蛋白质,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,不编码蛋白质，有调控作用,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,外显子,内含子,与,RNA,聚合酶,结合位点,（间隔的、不连续的）,真核,细胞的基因结构,1.,从,基因文库,中获取目的基因。,(1),概念：,将,含有某种生物不同基因的,许多,DNA,片段,，导入受体菌的,群体,中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为,基因文库,。,一、目的基因的获取,(2),分类：,(3),基因文库的构建,基因组文库,部分基因文库,基因组文库：,包含了一种生物所有的基因。,部分基因文库：,包含了一种生物的一部分基因。,基因组文库的构建,通过对受体菌的培养而储存基因,mRNA,单链,cDNA,双链,cDNA,反转录,DNA,聚合酶,cDNA,文库的构建,2.,利用,PCR,技术,扩增目的基因,（,1,）,PCR,_,反应,PCR,技术是一项在生物,_,复制,_,的核酸,合成,技术。（使用,PCR扩增仪,）,（,2,）原理：,（,3,）前提：,要有一段,_,的核苷酸序列，以便根据这一序列合成,_,。,（,4,）,过程,：,（,5,）,比较,PRC,技术与细胞中的,DNA,复制,一、目的基因的获取,DNA,双链复制原理,多聚酶链式,体外,特定,DNA,片段,已知目的基因,引物,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原料,条件,不同点,场所,酶,解旋,方式,结果,四种脱氧核苷酸,模板、,ATP,、酶,体外复制,细胞核内,热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,细胞内的,DNA,聚合酶、解旋酶,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化,在短时间内形成大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,3.,人工合成基因,一、目的基因的获取,反转录法,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,目的基因的,mRNA,单链,cDNA,双链,cDNA,(,即目的基因,),反转录,DNA,聚合酶,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,二、构建表达载体,同一种,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。,P15,思考,3&4,几种常见的转化方法：,1,、导入到植物细胞,2,、导入到动物细胞,3,、导入到微生物细胞,三、导入受体细胞,显微注射技术,转化,：目的基因,进入,受体细胞内，并且在受体细胞内维持,稳定,和,表达,的过程。,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法,三、导入受体细胞,导入植物细胞：,农杆菌转化法,土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染,双子叶,植物和,裸子,植物,三、导入受体细胞,基 因 枪 法：,单子叶植物,常用的一种基因转化方法，但成本较高。,三、导入受体细胞,花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的,转基因抗虫棉,就是用此方法获得。,三、导入受体细胞,显微注射法,重组,DNA,提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵发育 新性状动物,三、导入受体细胞,导入到微生物细胞,将目的基因转到大肠杆菌细胞中的操作步骤：,1),获得目的基因和质粒载体；,2),形成重组质粒；,3),用,Ca,+,处理，制备,感受态细胞,用重组质粒转化大肠杆菌细胞；,4),培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝；,5),筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。,1.,筛选含有目的基因的受体细胞,（,1,）抗药性筛选法,标记基因,（,2,）,DNA,分子杂交,：,2.,检测目的基因的表达,性状体现,（,1,）检测目的基因是否转录出了,mRNA,（,2,）检测目的基因是否翻译成蛋白质,（,3,）检测性状,四、目的基因的检测与鉴定,分子杂交,抗原,抗体杂交,个体生物学水平,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,四、目的基因的检测与鉴定,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的,单链,放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成,杂合双链区,；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,