生物学流式细胞仪学习PPT教案.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,一、流式细胞术（,Flow Cytometer,FCM,）,流式细胞术,就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。,流式细胞仪,(Flow Cytometer):,是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。,二、流式细胞仪结构,(1),流动室及液流驱动系统,;,(2),激光光源及光束成形系统,;,(3),光学系统,;,(4),信号检测与存贮、显示、分析系统，,(5),细胞分选系统。,三、检测原理,悬浮状态的细胞,单个流动通过,检测区，在那里,产生散射光和荧光,被采集，过滤 然后,转换成数字信号,存储于电脑上。,（一）让细胞单个流动通过检测区,Injector,Tip,Purdue University Cytometry Laboratories,Flow Cell,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,（二）检测信号,1,。散射光信号,散射光不依赖任何细胞样品的制备技术,(,如染色,),，因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）。,散射光分为,前向角散射,(FSC,，,Forward Scatter),和,侧向角散射,(SSC,，,Side Scatter),，,Forward Angle Light Scatter,FALS,Sensor,Laser,前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关,，确切说与细胞直径的平方密切相关。,通常在,FCM,应用中，选取,FSC,作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。,90 Degree Light Scatter,FALS Sensor,90LS Sensor,Laser,侧向角散射：,侧向角散射是指与激光束正交,90,度方向的散射光信号。,侧向散射光,对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。Laser,2,。荧光,信号,Fluorescence,FALS Sensor,Fluorescence detector,(PMT3,PMT4 etc.),四、流式细胞术的特点,分析群体细胞,所需时间短,多参数分析,定性或定量,流式细胞术,荧光显微镜,速度,高速分析，分析速度,10000,个细胞,/,秒,慢,多参数分析,可实现六参数十八个参数的同时分析,可同时检测的参数有限,分选,能够实现高速分选,不能,结果表示,定性定量,定性,高通量筛查,可直接利用细胞培养板进行上样,不能,四、流式细胞术的应用,可检测；,细胞大小,细胞的核质比例,细胞表面分子,细胞质内分子,细胞核内分子,可判断：,细胞类型,细胞活性,细胞生理状态,细胞周期,细胞分化（癌变）,细胞凋亡,可分选细胞,可用于：,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、,HLA-B27,分析、,PNH,诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、,AIDS,诊断与治疗和疗效评价、,flow-FISH,法测定端粒长度,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞（,DC,）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（,MDR,）、肿瘤相关基因表达研究、,RNA,测定、,DNA,测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、,血管内皮细胞研究,样品,单细胞,悬液,标记,荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,（一）流式细胞术操作流程,统计学,分析,继续,培养,细胞内的,DNA,含量随细胞周期进程发生周期性变化。,利用荧光染料,PI,标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内,DNA,的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。,(,二,),实例一、利用流式细胞术分析细胞周期,样品制备,1000,rpm 5,分钟收集,2X10,6,个细胞,PBS,漂洗,两次,70%,酒精,4,度固定过夜,收集固定的细胞,PBS,漂洗,0.5 PBS,悬浮细胞,2.5l,10g/l,RNase A,37,度消化,1,小时,过,300,目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI,（含,1%Triton),，,1000,rpm,5,分钟,两次,混匀，室温,静止,5,分钟,上机,检测结果,还可初步判断细胞凋亡,(,三,)实例,二,、,Annexin V-FITC,结合膜表,PS,实验检测细胞凋亡,流式的两种分选方式,:,-,机械式,-,带电式,（四）利用流式细胞仪分选细胞,1,。机械手臂式流式,将液流断裂成液滴,对含有目的细胞的液滴加上电荷,使用偏转电场将带电的含有目的细胞液滴偏转到对应的收集容器中,流式细胞术样本来源,细胞悬液：,外周血（溶血）、骨髓液,灌洗液、体腔积液,培养细胞,实体组织：,病理组织：新鲜样本,/,石蜡包埋样本,针吸组织：新鲜样本,三检测原理,悬浮状态的细胞,单个流动通过,检测区，在那里,产生散射光和荧光,被采集，过滤 然后,转换成数字信号,存储于电脑上。,Injector,Tip,Purdue University Cytometry Laboratories,Flow Cell,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、,HLA-B27,分析、,PNH,诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、,AIDS,诊断与治疗和疗效评价、,flow-FISH,法测定端粒长度,