生物化学和分子生物学：第十四章 DNA生物合成.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/11/9,#,第,十四,章,DNA,的生物合成,DNA Biosynthesis(Replication,),1,Structure,of DNA Nature,1953,Discovery of DNA Structure and Function,2,DNA,复制,(replication),:,以亲,代,DNA,作为合成模板，按照碱基配对原则合成,子代,DNA,分子,，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。,复制,亲代,DNA,子代,DNA,3,1.DNA,复制有哪些基本特征？,2.DNA,复制需要哪些酶？分别发挥何种功能？,3.DNA,的双螺旋结构在复制中发生何种变化？,4,.,原核生物是如何进行,DNA,复制的？,5,.,真核生物是如何进行,DNA,复制的？,6,.,线粒体,DNA,是如何复制的？,7.,逆转录合成,DNA,是如何进行的？,核心,内容,：,4,DNA,复制,的,基本,特征,Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,5,密度梯度离心试验,（,Meselson-Stahl experiment,）,6,半保留复制,(semi-conservative replication):,DNA,两条单链各自为模板按碱基配对原则合成互补链，所形成的子代,DNA,一,条,链来自,亲代、另一条从新合成，碱基序列与亲代,DNA,完全一致。,一、,DNA,以,半保留方式进行复制,7,二、,DNA,复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,8,复制子,(replicon),：含一个复制起始点的独立复制单元，是一个完整,DNA,分子或,DNA,分子上的某段区域。,ori,ter,原核生物环状,DNA,仅,一个复制点,(origin),是单复制子双向复制,9,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,真核生物每条染色体存在多个起始点，是多复制子复制,10,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),三、,DNA,一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,11,前导链或领头链,(,leading strand,),：,顺着,解链方向生成的子链，复制是连续进行,的。,后随链,(lagging strand,),：,复制方向,与解链方向,相反，是不连续,复制的,链。,复制中的不连续片段,称为,冈崎片段,(,O,kazaki,fragment),。,12,1.,半保留,(semi-conservative),DNA,复制的主要特征,:,2.,双向性,(bidirectional),3.,半不连续,(semi-discontinuous),4.,高保真性,(high fidelity),13,DNA,复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,Enzymology,and Topology of DNA Replication,14,1.,底物,(,substrate,),:,d,ATP,dGTP,dCTP,dTTP,；,2.,聚合酶,(polymerase,),:,依赖,DNA,的,DNA,聚,合,酶,3.,模板,(template,),:,解开成单链的,DNA,母链；,4.,引物,(primer,),:RNA,短链，为,dNTP,提供,3,-OH,末端；,5.,其他,的酶和蛋白质,因子,参与,DNA,复制的物质,:,15,DNAdependent DNA polymerase,（,DNA pol,），具有,5,3,的聚合活,性和核,酸外切酶活性,1.,原,核生,物,DNA,p,ol,：,DNA pol I;DNA pol II;DNA pol III,2,.,真核,生,物,DNA pol,：,DNA pol,;DNA pol,;DNA pol,;,DNA pol,;DNA,pol,一,、,DNA,聚合酶催化核苷酸间的聚合,16,多亚基不对称二聚体，结,构包括：,DNA pol III,(10,5,nt/min,),核心酶,核心酶,-,复合物,1,对,-,亚基（可滑动的,DNA,夹子）,亚基，,合成,DNA,；,亚基3,5,外切,酶活性；,亚基，,组装,核心酶：,17,DNA pol III,核心酶,核心酶,-,复合物,1,对,-,亚基（可滑动的,DNA,夹子）,亚基,：,柔性,连接,区确保,2,个,核心酶分别,负责合成前导链和后随链,。,功能,：,促,进全酶组装至模板,上，增强,核心,酶活性,-,复合物：,、,、,、,、,、,亚基,亚基：夹,稳,DNA,模板，促使,酶沿模板滑,动,18,功能：对复制中的错误进行校,读；对,复制和修复中出现的空隙进行填补,。,5,核酸外切酶活性,木瓜蛋白酶,F,G,A,F,A,R,G,R,3,5,核酸外切酶活性,小,片段,Klenow,DNA-pol I,，单肽，多个螺旋组成,19,E.Coli,真核细胞,功能,填补复制中的,DNA,空隙，,DNA,校对和修复,DNA,损伤应急修复,DNA,修复,线粒体,DNA,合成,/,前导链及后随链合成，错配修复,DnaG,引物酶,真核生物和原核生物,DNA,聚合酶的比较,20,二,、,DNA,聚合酶的碱基选择和校对功能,实现复制的保真性,DNA,复制的保真性至少依赖三种机制：,1.,遵守严格的碱基配对规律；,2.,聚合酶在复制中对碱基的选择功能；,3.,复制出错时有,DNA,聚合酶具有即时校读功能。,21,1.,DNA pol,对碱基的正确选择,DNA pol,对核苷酸的参入具有选择功能,2.DNA pol,的,核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶,(exonuclease),是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,复制保真的酶学机制,22,A,：,DNA-pol I,的,外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。,B,：碱基配对正确，,DNA-pol I,不,表,现外切核酸酶活,性。,DNA pol,的,校读功能,23,解链过程,中必然产生正,超螺,旋,10,8,局部解链后,如何解链？,24,多,种酶参与,DNA,解链和稳定单链状态,DNA,拓扑异构酶改变,DNA,超螺旋,状态,三、,复制中的分子解链伴有,DNA,分子拓扑学变化,25一）多种酶参与,DNA,解链和稳定单链状态,26,解,螺旋酶,(,helicase),利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链,。,引物,酶,(primase),复制起始时催化生成,RNA,引物的酶,。,单链,DNA,结合蛋白,(single stranded DNA binding protein,SSB),与单链,DNA,结合，在,复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,27,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中一股链，使,DNA,解链旋转不致打结,；封,闭切口，,DNA,变为松弛,状态，无需,ATP,供能,。,拓扑异构酶,切断,DNA,分子两股链,，双链,DNA,通过切口使,超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,（二）,DNA,拓扑异构酶改变,DNA,超螺旋,状态,28,Topo II,在复制叉附近区域切断,DNA,双链，未复制的,dsDNA,穿过切口移去正超螺旋进入负超螺旋状态，断端在酶的作用下连接恢复,，,ATP,供,能。,29,复制叉处的蛋白协同作用,30,DNA ligase,：催化,DNA,缺口,(nick),上游单链,3,-,OH,和下游单链,5,-,P,间形成,磷酸二酯键,，连接,成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,四,、,DNA,连接酶连接DNA,双链中的单链缺口,31,提供核糖,3,-OH,提供,5,-P,结果,DNA,聚合酶,引物或延长中的新链,游离,dNTP,(dNMP),n+1,连接酶,复制中不连续的两条单链,不连续连续链,拓扑酶,切断、整理后的两链,改变拓扑状态,DNA,聚合酶，拓扑酶和连接酶催化,3,5,-,磷酸二酯键生成的比较,32,原核生物,DNA,复制过程,The Process of DNA,Replication in Prokaryotes,第 三 节,33,两,个问题：,1,.,DNA,解开成单链，提供,模板,2.,形成引发体，合成引物，提供,3,-,OH,一,、复制的起始,34,E.coli,复制起始点,oriC,的序列特征,（识别区）,（,AT-rich,）,35,1.DnaA-ATP,识别结合反向重复序列区,2.DnaA,蛋白多聚，促使,AT-rich,区解链,3.DnaB,在,DnaC,协同下识别,AT-rich,区,4.DnaB,活化，解开双链并沿解链方向移动。,（一）,In,E.coli,解链过程由,DnaA,、,B,、,C,三种蛋白完成,36,含有,解旋,酶,(DnaB),、,DnaC,蛋白、引物酶,(DnaG),和,DNA,复制起始,区的,复合结构称为,引发体（,primosome),。,(,二,）,引发体形成和引物合成,37,3,3,5,3,5,引物,是由引物,酶催化,NTP,聚合所生成,的短链,RNA,分子。,引物,3,HO,5,引物酶,引物,长度约为十到几十个核苷酸。,引物合成的方向,5,3,。,38,复制的,延长：在,DNA-pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或,延伸中,的子,链，化学,本质是磷酸二酯键的不断生成。,二、,DNA,链的延长：,领头链连续复制，随从链不连续复制,39,领头链的合成,：沿,5,3,方向连续延伸,40,随从,链,的合成,：,延长方向与解链方向相反,，复制叉,解开,至,一定,长度时生成,引物并延长子链。,41,同,一,复制叉处由一个,DNA-pol,同时合成前导链和后随链,42,原核生物,DNA,双向复制在复制终止,点,(ter,),汇合,三、复制终止：,切除引物、填补空缺、连接切口,43,后随链,上不连,续片,段的连接,：,RNase,水解,引物，,DNA Pol I,填补空缺，连接酶连接缺口,44,真核生物,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Biosynthesis,in Eukaryotes,第 四 节,45,真,核生物复制子,多，复制具有时序性；,冈,崎片段,短，,DNA,聚合酶聚合效率低、复,制叉前进速度慢等,；,DNA,复制从引发进入延伸阶段发生,DNA,聚合酶,/,转换,；,核酸酶,RNaseH I,和,FEN1,切除冈崎片段引物。,真核生物与原核生物,DNA,复制的,差异,46,复制,起始点比,E.coli,的,OriC,短,，酵母,复制起点为,11bp,富含,AT,的自主复制序列（,autonomous replication sequence,，,ARS,）,双,链打开成复制叉，形成引发体、合成引物,复制起始需,DNA pol,、,pol,、拓扑酶和复制因子,(replication factor,RF),参与。,一,、,真核生物,复制的,起始与原核生物基本相似,47,同源三聚体，与,E.coli,DNA,聚合酶,III,b,亚基的结构及功能相似，,形成闭合环形的可滑动,DNA,夹子,；,使,pol,d,获得持续合成的能力,。,PCNA水平是检验细胞增殖的重要指标,。,增殖细胞核抗原（,proliferation cell nuclear antigen,PCNA),48,二,、,真核生物复制的延长发生,DNA,聚合酶,/,转换,前导链：出现在引发后期,后随链：发生于每个冈崎片段合成之际,发生,DNA,聚合酶,/,转换的,原因：,Pol,不具备持续合成,能力；冈崎片段长度仅为一个或若干个核小体所含的,DNA,。,DNA,聚合酶,/,转换的,关键蛋白是,RFC,和,PNCA,。,49,原有组蛋白大部分可重新组装至子代,DNA,链上。,三、真核生物,DNA,合成后立即组装成核小体,50,染色体,两端,DNA,子,链最后,复制的RNA,引物去除,后留下空隙,。,DNA,单链易被酶解，经多轮复制后造成染色体缩短。,线性染色体末端复制的问题,51,真核生物,染色体线性,DNA,分子末端的,结构，由富含,TG,的重复序列组成。,功能,：,维持,DNA,复制的,完整性，保持染色体稳定,结构,特点：,由末端单链,DNA,和,蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G,、,T,碱,基的短,序列，每个末端的,3,端比,5,端长，形成单链,ssDNA,。,人的端粒重复序列为,5-(TTAGGG)n-3,端粒,(telomere),52,端粒酶（,telomerase,）,是一种,核糖核蛋白，,由,RNA,和蛋白质组成。,端粒酶以自己的,RNA,组分作为模板，以染色体的,3,端,ssDNA,为,引物，将端粒序列添加于染色体的,3,端,端粒酶组成：,端粒酶,RNA,；端粒,酶协同蛋白,(hTP1),端粒,酶,逆转录酶,四、端粒,酶参与解决染色体末端复制问题,53,端粒酶催化作用的爬行模型,端粒酶,RNA,的（,A,n,C,n,),x,配对母链,DNA,的,(T,n,G,n,),x,序列；,DNA,母链以端粒酶,RNA,为模板进行,3,末端延伸；,端粒酶爬行至,DNA,链新合成的,3,末端，以逆转录方式延伸,DNA,母链,重复上述步骤直至,DNA,母链至合适长度，端粒酶脱离母链；,DNA,母链,3,末端反折，在,DNA-pol,催化下完成末端双链复制。,54,绝大多数体细胞,（端粒酶活性很低或没有）,端粒随细胞分裂而逐渐缩短,20-60,代后细胞老化或死亡,端粒酶活性上调,细胞永生化,癌症,端粒酶高活性的细胞：,生殖细胞,早期胚胎细胞，包括胚胎干细胞,成体干细胞，如造血干细胞,90%,以上的癌细胞,端粒酶基因突变或功能异常与许多人类疾病有关,端粒酶在人类发育和疾病中的作用,55,五、真核生物染色体,DNA,在每个细胞周期中只能复制一次,G1S,及,G2M,受到蛋白激酶调节,，包括,调节亚基细胞周期蛋白,(cyclin),和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶,(cyclin dependent kinase,CDK),。,56,复制基因的选择,出现于,G1,期,，基因组的每个复制基因位点均组装,前复制复合物（,pre-replicative complex,，,pre-RC,）,。,复制起点的激活,出现于,细胞入,S,期,，,激活,pre-RC,，募集若干复制基因结合蛋白和,DNA,聚合酶，并起始,DNA,解旋。,DNA,复制起始,分两步,进行,57,ORC,至少募集两种解旋酶加载蛋白,Cdc6,和,Cdt1,。,复制起点识别复合物（,origin,recognition complex,，,ORC,）识别并结合复制基因。,三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶,Mcm2-7,。,前复制复合物（,pre-RC,）的形成,58,在,S,期,，,pre-RC,被蛋白激酶,（,CDK,）,磷酸化，从而被,激活，导致,在复制起点组装其它复制因子并起始,复制。,复制,因子包括,DNA,聚合酶和引物酶,。,59,逆转录和其他复制方式,Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways,第五节,60,RNA,模板,逆转录酶,(reverse transcriptase),DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,逆转,录,(,reverse transcription),一、逆转录病毒的,基因组,RNA,逆转录复制机制,61,逆转录酶表现出三种酶活性,RNA,依赖的,DNA,聚合酶,D,NA,依赖的,DNA,聚合酶,RNase H,62,D,环复制的特点是：复制起始点不在双链,DNA,同一位点，内、外环复制有时序差别。,催化线粒体,DNA,复制：,DNA-pol,g,二,、线粒体,DNA,按,D,环方式,复制（,D-loop replication,）,dNTP,DNA-pol,63,1.,原核生物,DNA,的复制体系有哪些酶及蛋白质成分？各有何作用？,2,.,真,核生物,DNA,的复制如何实现高速及保真性？,3,.,端粒有何作用？为何有些肿瘤的发生与端粒有关？,4,.,冈崎片段合成结束时是如何连接的？,5,.DNA,聚合酶、拓扑酶和连接酶都催化,3,，,5-,磷酸二酯键的生成，各有何不同？,6,.,简述逆转录的基本过程和逆转录现象发现的重大研究价值。,64,