检验核医学：放射性核素示踪技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,放射性核素示踪技术,radioactive nuclide tracer method,放射性示踪技术的特点,常用方法及应用,放射性示踪实验设计原则,放射性示踪应用进展及讨论,应用思考,1,食物中有两种含甲基的化合物,胆碱和蛋氨酸，其甲基部分可相互转移，彼此代替，并供给肌酸与肾上腺素合成的需要。,其转移过程是以甲基作为完整基团直接转移，还是分解后重新形成？,应用思考,2,3-,羟,-3-,甲基戊二酰辅酶,A,还原酶主要存在细胞的内质网，能催化,HMG-CoA MVA,该酶是胆固醇生物合成关键限速酶,有多种因素,(,药物、激素、代谢物）主要通过调节此酶活性影响胆固醇合成,如何测定其活性,?,应用思考,3,从某中药中提取得某单体，可能对瘤细胞,DNA,合成有抑制作用,如何设计一体外实验验证？,应用思考,4,如何比较口服止血药,A,及剂型改进型,B,对消化道出血的治疗效果？,如何比较某些药物增加或降低冠状动脉血流量？,应用思考,5,某生物制剂对神经损伤有修复作用，现将其制成海绵敷贴剂，以延长作用时间（缓释作用）,如何设计一实验，证明此敷贴剂对神经损伤创面的缓释作用？,应用思考,6,某新型肿瘤单克隆抗体在肿瘤组织有较好的特异性浓聚。,如何设计一实验证明其浓聚程度？,应用思考,7,如何监测干细胞的移植,一、概念,放射性核素示踪技术是利用放射性核素及其标记化合物作,示踪剂,来研究生物体内各种代谢物质的吸收、分布、排泄、转移规律及疾病诊断的一门科学。,Label:,放射性核素,Substance,：观察对象,System:,整体、离体,Labeled-Substance,吸收、分布、排泄,放,射,性,核,素,示,踪,技,术,*,放射性核素稀释法,*物质吸收、分布、转化、排泄的示踪研究,*放射性核素示踪动力学,细胞动力学的示踪研究,药物代谢反应机制的示踪研究,分子生物学的示踪研究,特定探针（单克隆抗体、配基）的示踪研究,.,二、原理,放射性核素及标记化合物与 相应普通原子及分子具相同 的生物学性质,.,如,I,与,125,I,、雌二醇与,3,H-,雌二醇 放射性核素发出的射线可记录分析,三、放射性核素示踪的特点,灵敏度高,检测方法简单,合乎生理条件,定位准确,非创伤性,待,分,析,物,析,量,g,比,色,分光,光度色,质,谱,层,析,放射性核素示踪,技术,10,-2,10,-8,10,-8,10,-10,10,-15,10,-18,四、常用示踪方法及其应用,放射性核素稀释法,物质吸收示踪法,物质转化示踪法,物质分布示踪法 物质示踪动力学,放射性核素稀释法,radionuclide dilution technique,利用化学物质在稀释前后质量不变的原理与示踪技术相结合而建立的微量物质定量分析方法,基本公式,A,：放射性示踪剂的总活度,S1,、,m1,：混合前示踪剂比活度与质量,S2,、,m2,：混合后的比活度及非标记物质量,例,1,：某样品中含有残留甲胺磷，加入比活度为,450000dpm/mg,的,32,P,标记的甲胺磷,0.02mg,混匀后分离得,0.1mg,甲胺磷的放射性为,2000dpm,求样品中的甲胺磷含量。,例,2,以,14,CO,2,通过植物的光合作用生成放射性蛋白。取其中少量蛋白水解分离出部分谷氨酸比活度为,508dpm/mg,，欲求谷氨酸的含量，取,126mg,放射性蛋白样品，水解后加入非标记谷氨酸,10.7mg,，混匀后，分离出少部分谷氨酸测得其比活度为,328dpm/mg,，求标记谷氨酸的量及蛋白中标记谷氨酸的重量百分比？,标记谷氨酸的重量百分比为：,32.44126=25.7%,物质转化示踪研究揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物和产物的关系以及完成某种转化的必要条件,参入实验,(incorporation experiment,）是放射性核素示踪技术应用到研究生物体内物质转化的重要方法,.,参入实验,(incorporation experiment),研究生物体系中化合物,A,与,B,是否为产物和前身物的关系或转化的必要条件,基本原理,A B?,*A *B,主要参数,参入实验的类型,整体参入实验,离体参入实验,参入实验应用,1淋巴细胞转化实验细胞免疫功能肿瘤细胞增殖,铅中毒病人淋巴细胞转化率,淋巴细胞转化率（,10,4,CPM/10,6,淋巴细胞,）,病人,n=60 21.2710.32,正常,n=100 48.9621.46,2.,代谢物转化实验,细菌放射呼吸实验：,原理：细菌,CO,2,14,C-,葡萄糖、,14,C-,氨基酸,14,CO,2,设备：细胞代谢快速闪烁计数器,滤膜,培养液,细菌放射呼吸实验的应用：,生长指数（,GI,）,测定：,GI=C,i,/C,0,GI,3,为阳性,细菌倍增时间（,t,2x,）,测定：,logR,2,-logR,1,=K(t,1,-t,2,)t,2x,=0.301/K,R,2,为,t,2,的计数，,R,1,为,t,1,的计数，,K,为对数生长期的速度常数。,常见需氧菌倍增时间（,min,）,菌种,t,2x,菌种,t,2x,大肠杆菌,27.50.7,炭疽杆菌,38.05.2,产气杆菌,28.70.5,枯草杆菌,48.82.3,肠炎沙门氏菌,43.75.5,福氏痢疾杆菌,51.54.1,粘质沙雷氏菌,44.31.6,宋内氏痢疾杆菌,29.70.1,腊样杆菌,33.60.8,金黄色葡萄球菌,40.93.6,巨大芽孢杆菌,40.12.0,白色葡萄球菌,74.58.7,3.,参入竞争抑制实验：,体外抗肿瘤药物筛选,Drug IR,（,%,）,ADM 57.73,Carbo 29.38,BLM 38.26,VCR 56.80,Taxol 63.35,Holoxan 32.97,MMC 19.34,DTIC 38.31,ADM+Carbo 70.90,VCR+Carbo+BLM 81.45,卵巢癌常用化疗药物体外敏感实验,五、放射性示踪实验设计的,基本原则与方法,1.,放射性示踪实验的类型,整体示踪实验,离体示踪实验,2.,注意事项,实验准备阶段,:,选择合适示踪物,射线类型 半衰期 放化纯度 比活度 核素标记位置,选择合适的测量方法,实验阶段,:,示踪剂量估算,稀释作用,组织浓聚作用,实验周期及安全剂量,示踪剂引入途径,静脉、腹腔、皮下、肌肉注射口服、灌胃敷贴、涂布,放射性样品的制备,核素特性 生物样品特性,数据处理,放射性含量 比活度 相对比活度,思考题,放射性示踪技术的原理是什么,?,有何主要技术特点,?,参入实验的基本原理是什么,?,有何主要用途,?,放射性示踪技术应用进展,干细胞定位,免疫杀伤,细胞增殖,放,射,性,核,素,示,踪,技,术,物质吸收、分布、转化、排泄,放射性核素示踪动力学,细胞动力学,药物代谢,特定探针（单克隆抗体、配基等）,放射体外分析（,RIA,、,RBA,、,REA,）,.,应用思考,1,食物中有两种含甲基的化合物,胆碱和蛋氨酸，其甲基部分可相互转移，彼此代替，并供给肌酸与肾上腺素合成的需要。,其转移过程是以甲基作为完整基团直接转移，还是分解后重新形成？,转甲基实验中甲基上,2,H/,14,C,比值,2,H,（百分超）,14,C,（,cpm/mmol,）,2,H/,14,C,蛋氨酸,61.52,3.6510,6,1.6910,-5,胆 碱,6.98,4.0710,5,1.7210,-5,肌 酸,3.02,1.7510,5,1.7210,-5,实验结果表明，产物中,2,H/,14,C,的比值与前身物基本一致，说明转甲基过程是整个基团的转移，即体内甲基作为一个整体基团参加代谢过程,应用思考,2,3-,羟,-3-,甲基戊二酰辅酶,A,还原酶主要存在细胞的内质网，能催化,HMG-CoA MVA,该酶是胆固醇生物合成关键限速酶,有多种因素,(,药物、激素、代谢物）主要通过调节此酶活性影响胆固醇合成,如何测定其活性,?,应用思考,3,从某中药中提取得某单体，可能对瘤细胞,DNA,合成有抑制作用,如何设计一体外实验验证？,应用思考,4,如何比较口服止血药,A,及剂型改进型,B,对消化道出血的治疗效果？,如何比较某些药物增加或降低冠状动脉血流量？,应用思考,5,某生物制剂对神经损伤有修复作用，现将其制成海绵敷贴剂，以延长作用时间（缓释作用）,如何设计一实验，证明此敷贴剂对神经损伤创面的缓释作用？,应用思考,6,某新型肿瘤单克隆抗体在肿瘤组织有较好的特异性浓聚。,如何设计一实验证明其浓聚程度？,应用思考,7,如何监测干细胞的移植,?,生物利用度,(,时相曲线下面积,area under curve AUC),关于物质吸收的示踪研究,趋靶性研究,分子识别与靶分子,分子靶向（,molecular targeting,）,分子识别,分子识别是分子与分子之间的选择性相互作用,是普遍的生物学现象,分子识别是现代分子核医学的理论基础,分子识别与靶分子,受体与配体的分子识别（高亲和力，高特异性）,抗原与抗体的分子识别（高特异性）,酶与底物的分子识别,(,专一性，信号放大）,特异蛋白之间的分子识别（特异性）,核苷酸链之间的分子识别,（单链反义核糖核酸（,RNA,）与细胞质内的,mRNA,）,蛋白质与核酸分子的分子识别,激素受体复合物，通过特异的序列激素反应元件识别、结合基因调控序列）,受体与配体的分子识别,受体研究涉及到细胞之间、细胞与其它分子之间的识别、信息传导及细胞生理或病理反应等基本的生命现象。,抗原与抗体的分子识别,抗原分子表面的抗原决定簇与抗体分子的可变区的抗原结合部位,.,酶与底物的分子识别,酶是一类具有分子识别功能的蛋白质，它与底物的作用具有专一性。,底物分子只能结合在酶活性中心的特异的结合部位才能发生作用。,一个酶分子可与多个底物作用，放大信号，利于检测及其微量的酶。,多位于胞内（金属蛋白酶位于胞外），需要能快速扩散或转运机制（与受体不同）。,特异蛋白之间的分子识别,体内某些蛋白质与蛋白质之间有特定的结合能力。如甲状腺素与甲状腺结合球蛋白、生物素和亲和素的特异结合等,。,核苷酸链之间的分子识别,单链反义核糖核酸（）与细胞质内的，反义脱氧核糖核酸（）与靶基因链的互补链的结合等,。,蛋白质与核酸分子的分子识别,如某些激素可与细胞核内的受体结合，形成激素受体复合物，通过特异的序列激素反应元件识别、结合基因调控序列，最终达到调节转录的目的。,分子靶向,（,molecular targeting,）,各种分子（显像或治疗药物）通过与在疾病状态下明显高表达或缺失的靶分子的相互作用而特异性浓集。,反映的是特异性作用，而不是扩散、膜通透性等非特异性作用（传统示踪剂）。,分子靶向显像,receptor-ligand model;,antigen-antibody model;,transporter-substrate model;,enzyme-substrate model;,complex or hybrid model.,分子靶向治疗,射线照射致,DNA,损伤引起细胞发生,改变引起修复或凋亡或死亡或突变,.,干细胞定位,干细胞示踪是干细胞治疗临床应用的重要问题,移植干细胞临床应用监测,:,可重复、无创伤,干细胞示踪,染料标记,荧光染料法,5,溴,-2,脱氧尿苷,转报告基因标记,(GFP),预先标记干细胞 特定时间取组织,检测特异性标记 鉴别组织来源,放射性核素示踪,生化显像,随时动态提供生物活体信息,关键：,筛选干细胞特异性标志,研发相应特异性示踪剂,转铁蛋白受体,（,transferrin receptor,TfR),化学治疗和基因治疗靶点,高表达于快速增殖细胞,间充质干细胞移植研究,随着干细胞及分化后细胞的高特异性生物标志的筛选及示踪剂的进一步研发，以干细胞自身生物标志为靶点，应用核医学示踪技术监测，可追踪移植干细胞的,分化时相,，获得不同阶段的生物学信息。是一种更特异、更可靠的有效手段。,关于,PET,显像,正电子断层显像,目前核分子影像学最先进的核显像设备,PET,的放射性探测效率、空间分辨率、探测灵敏度、均匀度、对比度和重复性等各项仪器指标都明显优于,SPET,，可定量地得到体内生化代谢和功能变化的核分子影像图。,PET,的临床应用,PET,从分子水平诊断许多疾病，可以更早期、准确、定量、客观，特别适用于肿瘤、冠心病和脑部疾患。,PET,能够在体外无创伤地“看到”生命的现象；,PET,可揭示人脑的奥秘。,PET,将可能介入中药作用机理、经络本质的探讨。,将,PET,功能分子成像技术与,CT,成像技术有机地结合在一起。,优势：通过一次扫描既能够获得人体全身,CT,的解剖图像，同时又能够获得全身,PET,的功能代谢图像，实现了对疾病的早期诊断、性质判断、精准定位及疗效评价等。,适用范围广，在肿瘤的定位和分期脑部疾病与心脏病方面效果最佳。,PET-CT,（,融合探测仪）,2D+3D+4D=CT/PET,分子核医学不再从器官定向的角度，即从大小、形态结构和功能的角度去认识疾病，而是从问题定向即从生理、生化的角度，并深入至分子水平去认识疾病，回答的是有关细胞信号转导、基因表达、生化代谢等方面的问题。,二、免疫杀伤,单克隆抗体,修饰单克隆,双向单克隆抗体,双向单克隆抗体,利用两株不同杂交瘤在进行杂交，得到的双重杂交瘤保留了父母到杂交瘤分泌单克隆抗体特性。,分泌的单克隆抗体可同时结合父母到杂交瘤所分泌单克隆抗体能够识别的抗原,双向单克隆抗体,关键,:,双向单抗的制备,肿瘤,C,双向单抗,细胞毒素,.,抗体依赖性细胞介导细胞毒实验,(ADCC),51,Cr,（释放率）,评估细胞活性，探讨各种疾病过程细胞的作用,测定,McAb,活性,检测血清中微量抗体（如肾移植中细胞毒抗体）,检测血液中游离免疫复合物,51,Cr-,靶细胞,McAb,效应细胞,放射性核素标记靶细胞释放实验,+,3,H(,释放率）,肿瘤免疫机理探讨,临床免疫治疗效果评价,3,H-TdR,靶细胞,NK,细胞,放射体外分析,放射免疫分析,放射配基结合分析,酶的放射分析,酶的放射分析,+,Enzyme,标记底物,标记产物,3-,羟,-3-,甲基戊二酰辅酶,A,还原酶,主要存在细胞的内质网,能催化,HMG-CoA MVA,胆固醇生物合成关键限速酶,各种影响胆固醇合成因素,(,药物、激素、代谢物）主要通过调节此酶活性,