发酵工程：4第四章 发酵工程灭菌技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 发酵工程灭菌技术,第一节 培养基灭菌,第二节 发酵工程培养基的过滤除菌,第三节 空气过滤除菌,第四节 发酵罐废气的过滤除菌,本章学习要点,1,、,掌握发酵工程培养基灭菌和空气除菌的原理、方法和相关计算设计。理解培养基灭菌的残留定律和空气过滤除菌的对数穿透定律。,2,、,了解培养基灭菌和空气除菌的方法及设备流程；提高空气过滤效率措施；理解培养基连续灭菌和分批灭菌的特点及高温短时灭菌技术原理；培养基连续灭菌和分批灭菌技术的应用。,3,、了解,影响培养基灭菌的因素；掌握常用空气过滤介质类型和特点,；,理解L90,的意义。,教学要求：,掌握培养基和设备灭菌的意义和方法。分批灭菌和连续灭菌的优缺点比较。培养基灭菌的工程设计、培养基与设备、管道灭菌条件。,重点：,要求深刻理解与熟练掌握的重点内容,1,、常用的各种灭菌方法及在发酵工业中的选用。,2,、培养基灭菌原理，分批灭菌和连续灭菌的概念。,难点：,1,、培养基灭菌方法的选用。,2,、培养基灭菌的理论基础。,讲述的内容,第一 培养基灭菌的目的、要求和方法,第二 湿热灭菌的理论基础,第三 培养基灭菌的工程设计,染菌的危害性,灭菌的方法,培养基灭菌的要求,液体培养基灭菌的特点,知识点：,热灭菌原理,重点：,一、概述,第一节,培养基灭菌,微生物的培养过程：,培养基配制灭菌接种培养,工程上的灭菌是指用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌营养体和芽孢或孢子的方法。,消毒是消除病原微生物的措施。,在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,灭菌的目的：纯种发酵。,1.,灭菌的定义,用物理或化学因素除去物品上所有生活微生物的方法。,（一）灭菌的概念和必要性,从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌的意思，英文中的“,dis-infection”,也是“消除传染”的意思。,所以，消毒是一种采用,较温和的理化因素,，仅,杀死物体表面或内部一部分对人体有害的,病原菌,，而对被消毒的物体基本无害的措施。,消毒（,disinfection,）,灭菌与消毒的区别,灭菌,：用物理或化学方法杀死或除去环境中,所有微生物,，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子,消毒,：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的,病源微生物,。,防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。,（,1,）低温,（,2,）缺氧,（,3,）干燥,（,4,）高渗,（,5,）高酸度,（,6,）防腐剂,防腐（,antisepsis,）,化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。,用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。,化疗（,chemotherapy,）,为什么要进行培养基灭菌？,由于生物反应系统中通常含有比较丰实的营养物质，容易受到杂菌污染，由于杂菌的存在，会有以下各种不良后果：,1),生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。,2),由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使产品质量下降。,3),污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。,4),发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。,2,灭菌的必要性,3工业上具体措施,包括：,1,）使用的培养基和设备须经灭菌；,2,）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；,3,）设备应严密，发酵罐维持正压环境；,4,）培养过程中加入的物料应经过灭菌；,5,）使用无污染的纯粹种子。,4,培养基灭菌的目的,杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,1.,化学试剂灭菌,2.,电磁波、射线灭菌,紫外线、阴极射线、,X,射线、,射线,3.,加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）,火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌,（二）灭菌的方法,工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。,湿热灭菌简便、有效、经济。,常用的化学试剂：,氧化剂：,0.%0.25%KMnO,4,溶液、,05%1%,漂白粉溶液,醇醛类：,75%,酒精、,0.25%,新洁尔灭、,10%,甲醛溶液、环氧乙烷,酚类：苯酚溶液、来苏尔,1.,化学药物灭菌,利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等进行灭菌。,利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌。,紫外线、阴极射线、,X,射线、,射线,2.,电磁波、射线灭菌,高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。,每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。,3.,加热灭菌,连,巴氏灭菌法,(pasteurization),，亦称低温消毒法，冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。,巴氏灭菌法的产生来源于巴斯德解决啤酒变酸问题的努力。当时，法国酿酒业面临着一个头疼的问题：啤酒在酿出后会变酸，根本无法饮用。而且这种变酸现象还时常发生。巴斯德受人邀请去研究这个问题。经过长时间的观察，他发现使啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的，但是，这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀死乳酸杆菌，而又不会破坏啤酒本身。最后，巴斯德的研究结果是：以,5060,摄氏度的温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌和芽孢，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的酿酒业。这种灭菌法也就被称为“巴氏灭菌法”。,主要原理,在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。,巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在,4,左右的温度下保存，且只能保存,310,天，最多,16,天。,现行方法,当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。,“低温长时间”,(LTLT),处理是一个间歇过程，如今只被小型乳品厂用来生产一些奶酪制品。,“高温短时间”,(HTST),处理是一个“流动”过程，通常在板式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物，且在储存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏杀菌”主要应用于生产酸奶乳制品。,目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：,一种是将牛奶加热到,6265,，保持,30,分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达,97.3%99.9%,，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。,第二种方法将牛奶加热到,7590,，保温,1516,秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。,主要应用,主要为牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原菌又可使乳质尽量少发生变化。也就是根据对耐高温性极强的结核菌热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行加热处理的一种方法。其中，在,60,以下加热,30,分钟的方式，作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理，虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为高温灭菌（,sterilization,），也就是在,95,以上加热,20,分钟。巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵产品。,通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存较长时间。,巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍然要储存在较低的温度下（一般,4,），否则还是有变质的可能性。因此市场上很多出售袋装牛奶的方法是很不规范的。,巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，在所有牛奶品种中是最好的一种。其实只要巴氏消毒奶在,4,左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。,（,1,）干热灭菌法,利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌。,灭菌条件：,160,下处理,60min,将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，,160,170,维持,1,2,小时，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。,火焰灭菌（灼烧）,，利用火焰直接将微生物杀死。是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。,利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌。,灭菌条件：,121下处理,30min,多数细菌和真菌的营养细胞在,60,左右处理,5,10min,后即可杀死；,酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用,80,以上的温度处理才能杀死；,而细菌的芽孢最耐热，一般要在,120,下处理,15min,才能杀死。,（,2,）湿热灭菌法,湿热灭菌要比干热灭菌更有效。,a.,原生质在含水量高的情况下易变性凝固,b.,蒸汽的穿透力强,湿热灭菌效果：致死温度和致死时间,致死温度：杀灭微生物的极限温度。,致死时间：在致死温度下或以上灭死微生物所需时间。,热阻：微生物在某一特定条件下的死亡时间。,湿热灭菌分：,a.,分批灭菌,b.,连续灭菌,间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。,方法是：将待灭菌的培养基在,80,100,下蒸煮,15,60,分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或,37,下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复,3,天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。,加压,常规加压灭菌法,盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空气后将锅密闭，再继续加热至,121,（压力为,1kg,cm,2,或,15,磅英寸,2,），时间维持,15,20,分钟，也可采用在较低的温度（,115,，即,0.7kg,cm,2,或,10,磅英寸,2,）下维持,35,分钟,的方法。,此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。,连续加压灭菌法,在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。,主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在,135,140,下处理,5,15,秒钟。,连续加压灭菌法优点,因采用,高温瞬时灭菌,，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”（,120,，,30,分钟）提高产量,5,10,；,由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以,缩短了发酵罐的占用周期,，从而提高了它的利用率；,由于,蒸汽负荷均匀,，故提高了锅炉的利用率；,适宜于,自动化,操作；,降低,了操作人员的,劳动强度,。,高温对培养基成分的有害影响及其防止,消除高温有害影响的措施,（,1,）采用特殊加热灭菌法,（,2,）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；,（,3,）对含,Ca,2+,或,Fe,3+,的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；,（,4,）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在,112,即,0.57kg,cm,2,或,8,磅英寸,2,下灭菌,15,分钟）或间歇灭菌；,（,5,）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌,灭菌设备,l,、高压蒸汽灭菌,生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多,手提式灭菌锅，容量小，多用于某种培养基灭菌。,立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。,灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶,(,袋,),。但投资太大，适合大型菌种场使用。,立式灭菌锅,2,、常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过,500,公斤。,3,、烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。,（三）培养基灭菌的要求,培养基灭菌程度：因发酵系统而不同,（,1,）达到要求的无菌程度（即可以接受的范围）,（,2,）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,培养基灭菌需解决的问题：,灭菌的温度,灭菌的时间,（四）发酵工业培养基灭菌的特点,数量多,含有很多固体物质,有利于生产菌的生长,方便易行价格便宜,培养基灭菌应采用高温蒸汽灭菌,湿热灭菌,湿热灭菌的优点,蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；,蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；,蒸汽有很大的潜热；,操作方便，易管理。,培养基湿热灭菌需解决的工程问题,将培养基中的杂菌总数,N,0,杀灭到可以接受的总数,N,（,10,-3,），需要多高的温度、多长的时间为合理。,灭菌温度和时间的确定取决于：,杂菌孢子的热死灭动力学,反应器的形式和操作方式,培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,知识点：,致死温度、致死时间、热阻,微生物的热死原理,对数残存定律,菌温度与菌反应速度常数的关系,影响培养基灭菌的因素,重点：对数残存定律,难点：灭菌温度与反应速度常数的关系,二、加热灭菌的基本原理,（一）相关概念,致死温度：杀死微生物的极限温度。,致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。,微生物对热的抵抗力用,“热阻”,表示。热阻指微生物在某一条件下的致死时间。,营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。,相对热阻：在相同条件下两种微生物热阻的比值。,（二）培养基灭菌动力学,湿热蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。,由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。,用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的,要求是,:,既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营 养成分的破坏。,微生物的热死原理,对数残存定律,对数残存定律,热死灭动力学方程,某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分子反应。故在一定温度下，微生物受热死亡符合,单分子反应动力学,。在灭菌过程中，活菌逐渐减少，其减少量随残存活菌数的减少而逐减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌数成正比，即对数残存定律：,死亡速率,残存活菌数,灭菌时间（,min,）,热死速度常数（杀菌速度常数）,与菌的种类和加热温度有关（,min,-1,）。是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。,K,值俞小，则此微生物俞耐热。,N,0,-,灭菌开始,(t=0),时，原有活菌数（污染度,),N,t,-,经过灭菌时间,t,后残存活菌数,积分,存活率,将存活率与灭菌时间,t,在半对数坐标纸上标会可以得到直线。直线的斜率为,K,，,K,值越大表示微生物越容易死亡。,T,一定，,K,随微生物种类不同而不同。,如，在,121,，枯草芽胞杆菌,FS5230,的,K,：,0.047,0.063s,-1,；梭状芽胞杆菌,PA3679,的,K,：,0.03 s,-1,；嗜热脂肪杆菌,FS1518,的,K,：,0.013 s,-1,。,同一种微生物，营养细胞和芽胞的,K,值也有很大的差别，,营养细胞易于受热死亡,，,K,值很高。,120,灭菌,K,值可大致为,10,10,（,min,-1,）数量级，而细菌孢子的,K,值在,120,只有,10,0,数量级。,三、比热死亡速率常数,K,1,、微生物的种类对,K,值的影响,实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过,120C,时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。,1/10,衰减时间,D,值：,活得微生物在受热过程中减少到原来数目的,1/10(N/N,0,=1/10),所需要的时间。即有,D,与,K,成反比。,Arrhenius,方程,:,K=Ae,-,E/RT,E,活化能（,J/mol,），其值俞大，,k,值越低，微生物不易死亡,K,菌死亡的速度常数（,1,min,），,A,阿累尼乌斯常数，也称频率因子（,1,min,），因菌种不同而异,R气体常数（,8.36J,K.mol,）,T,绝对温度（,K,）（,273.15,）,2,温度对,K,值的影响,E,活化能（,J/mol,）。,其值俞大，,k,值越低，微生物不易死亡。,不同菌的活化能不同。,两边取对数得：,对,ln K=,E/RT+ln A,两边求,T,的导数,=,，,和,E,的关系：,E,越大，越大,细菌孢子热死灭反应的,E,很高，而大部分营养物质热破坏反应的,E,很低，因而将,T,提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（,ln(N/N0)=,K t,）；由于营养成分热破坏的,E,很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。,1,、营养成分的保持,培养基成分受热分解的反应也属一级反应，符合对数残存定律：,X,t,/,X,0,=e,-Kt,K,营养物破坏的反应速率常数,X,0,开始灭菌时营养物的初浓度,X,t,灭菌,t,时间后营养物的浓度,阿氏方程表述：,ln K=ln A,E/RT,灭菌对培养基中营养成分的影响,通常,E,比,E,大很多。化学反应动力学指出：在活化能大的反应中，反应速率随温度变化也大。故当温度升高时，杂菌死亡速率要比营养成分破坏速度快得多。故采用,HTST,（高温短时）方法，可以减少营养成分破坏。,灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养的破坏程度。,1,，连续灭菌的优缺点,优点,保留较多的营养质量,容易放大，较易自动控制；,糖受蒸汽的影响较少；,缩短灭菌周期；,在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；,发酵罐利用率高，蒸汽负荷均匀。,缺点,设备比较复杂，投资较大。,分批灭菌和连续灭菌的优缺点,2,，分批灭菌的优缺点,优点,设备投资较少,染菌的危险性较小,人工操作较方便,对培养基中固体物质含量较多时更为适宜,缺点,灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,培养基灭菌的工程设计,无菌的标准,根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取,N=10,-3,一、分批灭菌的操作,二、基础条件的确定,三、,灭菌效率的计算,分批灭菌的设计计算,一、分批灭菌的操作,间歇灭菌（实罐灭菌、实消）,将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备（一般是发酵罐）一起进行灭菌，也称实罐灭菌。这种方法不需专门的灭菌设备，在发酵罐中进行，灭菌效果可靠。分批灭菌对蒸汽的压力要求较低，在,3,410,5,Pa,（表压）就可满足要求，但在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。,在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。,间歇灭菌的优缺点,优点：,1.,设备投资较少,2.,染菌的危险性较小,3.,人工操作较方便,4.,对培养基中固体物质含量较多时更为适宜,缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,保证间歇灭菌成功的要素,内部结构合理,(,主要是无死角,),，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象,压力稳定的蒸汽,合理的操作方法,。,发酵罐的接管图,二、基础条件的确定,1,、污染度,N,0,一般假定位,10,4,10,6,个,/ml,2,、灭菌度,N,实际计算时取,N,10,-3,，即处理,1000,只有一个活微生物（一般是针对周期长，成本高的发酵）。,3,、,N/N,0,为灭菌程度的指标（总基准值、,总,）,。,例如：培养基,100m,3,，含菌,10,5,个,/ml,，要求灭菌后存活菌数,10,-3,个,/,罐，则,N,0,/N,=(100,10,6,10,5,/10,-3,)=10,16,，为计算方便，取,ln(N,0,/N,)=36.8,分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。,4,、污染菌的热死特性,要了解是否符合对数残留定律，确定,K,，,A,，,E,的值。对不同细胞，选取不同的,T,和,t,。,（,基质值的计算、维持时间计算：根据阿氏方程和中基准值计算,）,5,、培养罐中温度与时间的关系,大量培养液分批灭菌时，加热和冷却时 间不能忽略。总灭菌时间等于升温、保温和降温三段时间之和。,t=t,1,+t,2,+t,3,分批灭菌工艺设计,Richards,快速法,温度和压力的关系,泡沫问题,投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题,灭菌结束后应立即引入无菌空气保压,培养基间歇灭菌过程中应注意的问题,一、连续灭菌概念,连续灭菌（连消）：,培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入发酵罐的杀菌方法。,连续灭菌的优缺点：,优点,保留较多的营养质量,容易放大,较易自动控制；,糖受蒸汽的影响较少；,缩短灭菌周期；,在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；,发酵罐利用率高；,蒸汽负荷均匀。,缺点,设备比较复杂，投资较大，容易造成污染。,连续灭菌及其计算,连续灭菌中维持时间的计算,注意点：,1,、由污染程度（,N,0,起始总菌数）推算残留菌数,N,t,2,、灭菌失败几率即一定总菌数中残留菌数,例,1,：有一发酵罐内装,40m,3,培养基，在,121,0,C,温度下实罐灭菌，原污染程度为每,1,ml,有,210,5,个耐热细菌芽孢，已知,121,0,C,时灭菌速度常数,k=1.8min,-1,，求灭菌失败机率为,0.001,时所需时间。,解,：,N,0,=4010,6,210,5,=810,12,(,个,),N,t,=0.001,(,个,),k=1.8,(min,-1,),(N,t,/N,0,)=-kt,t=2.303/klg(N,0,/N,t,)=2.303/18lg(810,15,),=20.34(min),由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培,养基加热至,100,0,C,以上，这个作用较为显著，,故实际保温阶段时间比计算值要短。,例,2,某发酵罐内装,40m,3,培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为,131,0,C,，原污染程度为每,1ml,含有,210,5,个杂菌，已知,131,0,C,时灭菌速度常数为,15min,-1,，求灭菌所需的维持时间。,解：,N,0,=210,5,(,个,/ml),N,t,=0.001/(4010,6,)=2.510,-11,(,个,/ml),t=2.303/klg(N,0,/N,t,)=2.303/15lg(210,5,)/(2.510,-11,),=2.37 min,二、连续灭菌流程,1,、间接加热连续灭菌流程,采用薄板换热器将待灭菌的培养基进行加热。,流程图,薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图,薄板换热器,2,、直接加热连续灭菌流程,除采用间接加热装置外，还利用蒸汽直接加热。,优点：,1,、加热时间短,2,、可用于含悬浮颗粒的培养基,3,、成本低,4,、易清洁和维护,5,、蒸汽利用率高,缺点：,1,、易产生泡沫,2,、培养基被稀释,喷射加热真空冷却流程,加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏少。,典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图,连续灭菌设备的结构,套管式连消加热,喷嘴式连消加热器,连消塔,-,喷淋冷却连续灭菌流程,维持罐,喷射加热器,发酵培养基的过滤除菌,一、过滤除菌机理,1,、惯性作用,2,、扩散作用,3,、静电吸附,4,、拦截作用,二、过滤器的类型,1,、非固定孔径过滤器（非拦截作用）,2,、固定孔径过滤器 （拦截作用）,深层过滤,滤浆,滤饼,过滤介质,滤液,滤饼过滤,推动力：重力、压力、离心力,架桥现象,过滤除菌适用于含有热敏性物质的培养基，除菌要求：,1,、过滤后不含任何真菌、细菌、支原体等微生物,2,、过滤器表面吸附蛋白量尽量少（减少损失）,3,、过滤后培养基不含病毒,4,、过滤后不含内毒素,第三节 空气除菌,空气除菌的意义,空气中的微生物,好气性发酵对空气无菌度的要求,空气除菌的方法,过滤除菌的原理,空气过滤除菌流程,一,.,空气除菌的意义,好气性微生物的生长和合成代谢产物都需要消耗氧气。工业生产上均采用空气作为氧气来源。然而，空气中有各种各样的微生物，为保证纯种培养，必须将空气中的微生物除去或杀死。,二,.,空气中的微生物,空气中微生物的含量和种类随地区、高低、季节,空气中尘埃多少和人们活动情况而异。一般寒冷,的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少；离地面愈,高含菌量愈少；工业城市比农村含菌量多。据统,计大城市空气含菌数为,300010000,个,/m,3,。空气,中的微生物以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母、,霉菌、放线菌和噬菌体。,一个通气量为,40m,3,/min,的发酵罐，发酵周期为,125h,，所需要通入的空气量高达,310,5,m,3,三,.,好气性发酵对空气无菌度的要求,好气性发酵中需要大量无菌空气，但空气绝对无菌是很难做到的，也是不经济的，只要使在发酵过程中不至于造成染菌而出现,“,倒罐,”,现象，这就是通风发酵对无菌空气的要求。不同类型的发酵，由于菌种生长活力、繁殖速度、培养基成分和,pH,值及发酵产物等不同，对杂菌抑制的能力不同，因而对无菌空气的无菌程度要求也有所不同。,在工程设计上，一般要求,1000,次使用周期中只允许有一个杂菌通过。,空气除菌的方法,（,重点,）,1,、热杀菌,将空气加热到一定温度后保温一定时间,使微生物蛋白热失活而致死。,热杀菌是有效的，可靠的杀菌方法，但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气，以达到杀菌目的，这是十分不经济的。工业上是利用空气压缩时放出的热量进行杀菌。,2.,辐射杀菌,高能阴极射线、,X,射线、,、,射线、紫外线都能破坏蛋白质活性而起到杀菌作用。其中紫外线用的较多，它在波长,226.5nm-328.7nm,时杀菌最强。一般用于无菌室、手术室杀菌,。,3.,静电除菌,静电除尘法已广泛使用，除尘效率一般在,8599%,之间，但由于它消耗能量小，每处,1000,立方米的空气每小时只需电,0.20.8kw,。空气压头损失小，一般只在,420mm,水柱。静电除尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒，但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降所以静电除菌对很小的微粒效率很低。,4.,过滤除菌,绝对过滤,绝对过滤是介质之间的孔隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气中的微生物被滤除。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时间，操作简便，它是多年来受到受到国内外科学工作者注意和研究的问题。它采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于,0.5um,。,介质过滤,介质过滤除菌是目前工业上用的较多的空气除菌方法，它是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物，而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。,单根纤维过滤除菌的原理,当气流通过滤层时,基于滤层纤维的层层阻碍,迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动,从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生撞击,拦截,布朗扩散,重力及静电引力等作用,从而把微生物微粒截留,捕集在纤维表面上,实现了过滤的目的,.,1,、惯性冲击滞留作用,2,、滤层纤维阻挡作用,3,、布朗扩散作用,4,、重力沉降作用,5,、静电吸附作用,一般认为惯性撞击截留,拦截截留和布朗运动截留的作用较大,而重力和静电引力的作用则很小,空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生,摩擦粘附,而使微粒被滞留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞滞留。,纤维能滞留微粒的宽度区间,d,与纤维直径,d,f,之比称为单纤维的惯性碰撞捕集效率，用,1,表示,即,1,d/d,f,1,惯性捕集作用,实践证明，,1,是惯性力的无因次准数,的函数，,1,f(,),V,颗粒运动速度（,m/s,）,p,颗粒密度,(kg/m,3,),d,p,颗粒直径,(m)d,f,纤维直径,(m),空气粘度,C,气体在表面滑动的可宁汉姆修正系数,空气临界速度,V,c,：,1,=0,与纤维直径、颗粒运动速度（气流速度）有关可以下式表示：,滞留区域的大小决定于微粒运动的惯性力，所以，气流速度愈大，惯性力大，滞留效果也愈好。此外，惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。,当气流速度降到临界速度以下是时，微粒不再由于惯性碰撞而被截留。随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于,与过滤介质接触而被纤维吸附捕集,，这种作用称之为阻拦滞留。,单个纤维对微粒阻拦效率可表示为,R,微粒和纤维直径之比,空气密度（,kg/m,3,）,Re,空气流的雷诺准数,Re=d,f,V/,2,拦截捕集作用,(,阻截,),空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦滞留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦滞留并不起主要作用。,直径小于,1m,的微粒在运动中往往产生一种不规则的布朗运动而与纤维接触且附着于纤维表面而被捕集，且可使微粒间相互凝集成较大的粒子，,增加了微粒与纤维的接触滞留机会,从而发生重力沉降或被介质截留。但是这种作用只有在气流速度较低时才较显著，此种情况可大大增强阻拦截留作用。当这些微粒离开它们所处位置中心时就可能被阻集在纤维表面。,若微粒位置移动,2X,0,，则可用,2X,0,代替,d,p,，则可计算出由于扩散而导致的微粒阻集效率,3,。,3,布朗扩散捕集作用,重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。,就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。,一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。,重力沉降捕集作用,干空气对非导体的物质相对运动磨擦时，会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。,悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子,15%,带正电荷，,70%,带负电荷，,15%,中性，这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。,就纤维过滤器而言，重力沉降作用和静电吸附不计，则单个纤维的阻集效率,可表示为,1,+,2,+,3,静电吸附捕集作用,使空气通经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒滞留在介质中而达到除菌的目的。常用的,过滤介质一般是棉花、活性炭、超细玻璃纤维、石棉滤纸及烧结材料等。,过滤材料孔径一般比细菌大，对细菌的滞留主要靠滞留作用，由多种机制构成：惯性碰撞、阻拦、布朗运动、重力沉降、静电吸引等。,1,过滤除菌的机制,六、空气过滤器的设计计算,过滤除菌效率,穿透率,过滤效率,穿透率是经过滤后空气中剩留颗粒数与原有颗粒数之比，过滤效率是被捕集的颗粒数与原有颗粒数之比（也叫捕集效率）。,2,深层过滤除菌原理,介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。,对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流量有关。,影响介质过滤效率的因素,空气过滤时，其中的颗粒数,N,随着滤床厚度,L,的增加而减少，其规律可表示为,K,过滤常数（决定于过滤介质的性质和操作情况），,cm,积分得,上式即为对数穿透定律。,过滤常数,K,与许多因素有关，如空气流速,V,、纤维直径,d,f,、颗粒直径,d,p,和纤维填充密度等，一般经实验求得。,L,90,：过滤效率,90,的滤层厚度。,从上式可知，,K,越大，,L90,就越小。,过滤器的效率由过滤除去的颗粒数与最初进来的颗粒数比值决定。即：,3,深层过滤除菌的计算,L,滤层厚度,例题,一个,20m,3,发酵罐所需通气率为,10m,3,/min,，发酵周期,100h,。对过滤介质研究后认为最合适空气流线速度为,0.15m/s,，此时的过滤常数,k,值为,0.67cm,-1,，试计算过滤器的尺寸（发酵厂中空气含菌,200,个,m,3,，生产可接受的染菌几率为,10,-3,),。,2,上题中如将空气的线速度降低到,0.03m/s,，,K,值即下降,0.087cm,-1,，则在,min,内越过过滤器进入发酵罐中的微生物为多少？此时过滤层的厚度应增加到多少？,解：由对数穿透定律,过滤器的截面积可由空气的体积流速除以气流线速度得到，即,空气过滤常用介质,过滤介质是过滤除菌的关键,过滤对介质的要求：吸附性强，除菌效率高，耐受高温高压，不易被油水污染，阻力小，空气流量大，成本低，易更换。,常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、化学纤维、超细玻璃纤维、纤维板、石棉滤板等。,1,）棉花,棉花是最常用的过滤介质，通常要用纤维不太长的原棉，因为它具有一定的弹性，虽然几经湿热灭菌，干燥后仍能保持原有的疏松状态。,棉花的过滤阻力较活性炭大（,10,12,倍）。,2,）活性炭,活性炭通常被加工成粒状，其过滤效率比棉花低，但具有阻力小，吸附力强（可吸附空气中有害物质，如油、水）的特点，通常与棉花介质一起使用，减少过滤层的阻力。,3,）玻璃纤维,纤维直径越小越好。但太小强度低，阻力大。一般填充系数在,6-10%,，填充密度,130-280kg/m,3,，阻力损失比棉花小。,1,传统过滤介质,4,）超细玻璃纤维纸,高速过滤介质。低速过滤时以拦截扩散为主。当气流速度超过临界速度时，属于惯性冲击。,过滤效率高，阻力损失小。但机械强度差。,5,）石棉滤板,20%,纤维小而直的蓝石棉和,8%,纸浆纤维混合打浆压制而成。,过滤效率较低。,耐湿，能耐受蒸汽反复杀菌，使用时间较长。,1,）烧结材料过滤介质,有烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料等多种。,烧结聚合物如聚乙烯醇滤板（,PVA,）。可经受高温杀菌。,2,）微孔滤膜,是由高分子聚合物经压制、热熔粘接或在适当溶剂、添加剂和成孔剂中成膜而制成的薄膜。,孔径均匀，过滤精度高。可反复蒸汽灭菌，容尘空间大。,阻力小、更换方便、处理量大。,主要有两类产品：,一类是超细硼硅酸纤维滤材经特殊聚四氟乙烯涂层；,另一类是采用聚四氟乙烯疏水性滤材，单层膜。,2,新型过滤介质,空气过滤除菌设备及流程,（,重点,）,1.,压缩空气的预处理,空气经压缩后具有很高的温度,冷却后又具有较高的相对湿度,经过空气压缩机后的空气带有油滴,水滴、油滴污染空气过滤器,1,）压缩空气的冷却,压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧,增大发酵罐的降温负荷,增加发酵液水分的蒸发,给培养温度的控制带来困难,影响微生物生长,一般用列管式冷却器进行冷却,2,）除油除水,大气