检验核医学：受体的放射配基结合分析法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,受体的放射配基结合分析法,(Radioligand Binding Assay of Receptor,RBA),生命活动的物质基础：生理、生化反应,生物活性物质通过受体介导发挥作用（信息传递）,包括：激素、神经递质、生长因子、药物、毒物、抗原,受体功能异常与疾病,受体信息传递与药物研究,受体研究历程,1889 J.N.Langley:receptive substance Paul Ehrlich:receptor30,年代,A.J.Clark:,占领学说,(occupancy theory)50,年代E.J.Ariens:,内在活性,(intrinsic activity)R.P.Stephenson:,效能,(efficacy)60,年代 受体的,I-125,、,H-3,示踪技术,70,年代,Earl W.Sutherland,：第二信使学说,Lefkowitz,、,Goldstein,等：受体放射,配基结合分析技术,分离配基受体复合物,放射配基,+,受体分子,测定受体数量和亲和力,定性,RBA,通过配基与受体反应的量效关系及某些参数的变化等来判断受体的类型，单位点或多位点系统,受体与配基相互作用的特点,(,可逆或不可逆，合作作用,),。,定量,RBA,在已知配基与受体反应性质的基础上，通过结合反应给出一定组织或细胞中能与该放射配基结合的受体数称结合位点数,(number of binding sites),一,RBA,的有关基本慨念,受体,(receptor,R),存在于机体靶组织细胞上能与激素或药物，,生理介质 等特异结合从而引起整个生物效应的特定的接受点,(,结合位点,),。,配基,(ligand,L),能与受体特异结合,(,即具高亲和力,),的,化学物质统称为配基。,激动剂,拮抗剂,内源性配基,受体与配基的结合反应,简单单位点系统：受体与配基结合的,系统中只存在一种结合位点，即各个,受体分子表现出完全相同的结合特性,和生物效应，而且配基和受体分子以,：的关系结合，各受体分子间不表,现明显的正或负合作,2.,受体与配基的结合反应,饱和曲线,将待测的标本与标记配基在一定的条件下进行结合反应。标记配基的浓度从低浓度到饱和浓度具多个实验点；以标记配基的浓度为横坐标，复合物的量为纵坐标即成饱和曲线。通过饱和曲线，可以求出,KD,及,Bmax,值。,两种实验方案：多点法,(,饱和曲线,),、单点法,两种实验方案的比较,放射配基浓度 优点 缺点 用途,单点法 单个饱和浓度 操作简单 只能求出,Bmax,临床检验,样本量少 误差稍大,(,偏小,),药物筛选,多点法 从低到饱和浓 可以求出,Kd,操作繁琐,工作 受体理论研究,度,(7,10,个点,)Bmax,可信度高 量大,样本量大 检验反应性质,标记配基的选择,常选择与受体结合亲和力和特异性特别高的标记配基，而不一定是受体的生理激动剂,要求：,性质,:,与受体结合具高亲和力，高特异性,比活度 大于,30Ci/mmol(1.2TBq/mmol),放 化纯度大于,95%,具化学稳定性,3,H-E,2,纯化前后对,NSB,的影响,(DPM),纯度,(%),浓 度,(nmol/L),0.4 1.0 2.1 3.7,85.4(,纯化前,)512 1214 2708 4043,98.3(,纯化后,)374 827 2093 2836,非标记配基的选择,性质,与标记配基不一定属同一化合物，但必须两,者能竞争同一受体，并且非标记配基与受体,的特异性亲和力应尽可能高，,浓度,非标记配基在反应系统中的浓度 应达到标,记配基浓度的倍以上,(100,2500),，,使绝大多数受体都被它占领而不再与标记配,基结合,标本采集、保存及处理方法,一标本为兔子宫内膜，用,3,H-E,2,测定胞浆中的含量。新鲜标本的,含量为,51.39,5.57fmol/mg,蛋白。,标本保存温度及时间对,Bmax,的影响,(fmol/mg,蛋白,),保存方式,1 w 2 w 3 w 4w,液 氮,48.32,5.12 46.37,2.10 40.08,3.27 34.15,6.13,-40 46.10,4.33 34.58,4.29 25.59,5.40 21.03,3.91,3.,分离方法,目的,分离方法的要求,低,NSB,、有效性、快速,常用分离方法,DCC,法、离心法、过滤法,法,(,葡聚糖包裹活性碳吸附法,（,Dextran-Coated Charcoal DCC),基本原理：,在悬液中，活性碳被葡聚糖包裹，形成起着分子筛，未结合的、小分子的游离配基,(,),进入并被吸附，而结合的大分子复合物,(,),则不能进入而被排斥在外，经过离心，复合物从上清液中获得。,离心法,方法：将达到平衡后的反应液通过离心，将留于上清液中的游离配基倾去，经反复离心洗涤次后，便可达到分离的目的。,过滤法,方法：将反应液滴于玻璃纤维滤膜上，在持续负压下抽滤。同时用不含配基的冷冻缓冲液淋洗滤膜次，即可以将游离标记配基除去。整个抽滤过程应在的条件下完成，并在分配时间内完成，以免受体配基复合物解离。,分离过程中最大的容许时间为,0.15t,1/2,。因此确定分离时间，主要取决于其平衡解离常数,KD,值,分离时间的确定,Scatchard,作图,Woof,作图,Lineweaver-Burk,作图,Hill,作图（,Logit,作图）,RL,RT,RL,