第三章基因工程第一节基因工程工具酶-PPT.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章基因工程第一节基因工程工具酶,(一)、限制修饰系统得种类,1、,I,型,:,由三个基因构成,hsd,R,;,hsd,M,;,hsd,S,(,h,ost,s,pecificity for,D,NA,r,estriction,m,odification and,s,pecificity,)位于染色体上,三个基因构成一个复合体,限制酶需要,ATP,、,Mg,2+,、,SAM,(,腺苷甲硫氨酸),无特异切割位点。,2、,II,型,:,限制与修饰基因产物独立起作用,在,、coli,中这两种基因位于质粒上。,3、,III,型,:,修饰酶与型酶相同,hsd,与,hsd,基因产物结合成一亚单位,限制酶就是独立存在得。,上述三个系统中,只有,II,型限制酶与甲基化酶具有相当高得核苷酸识别特异性,因而被广泛用于基因工程中。,(二)、限制性内切酶得定义、命名,1、,定义,:,广义指上述三个系统中得限制酶;狭义指,II,型限制酶。,2、,命名,:,限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。,例如:,Hin,d,前三个字母来自于菌种名称,H、influenzae,“,”,表示菌系为型血清型;,“,”,表示分离到得第三个限制酶Eco,RI,Escherichia coli,RI,Hin,d,Haemophilus,influensae,d,Sac,I(II),Streptomyces,achromagenes,I(,),(三)、限制酶得特点,1、,识别顺序与酶切位点,)识别,-8,个相连得核苷酸,Mbo,I NGATCN,;,Ava,II GG(A/T)CC,Bam,HI GGATCC,:,Ppu,MI PuGG(A/T)CCPy,Not,I GCGGCCGC,;,Sfi,I GGCC N N N N N GGCC,CCGGN,N,N,N,N,CCGG,Fok,I 5,-,(,),9,-3,3,-,(,),135,外侧,产生,-,端突起,)富含,)对称性,双对称,Eco,RI 5,-G A A T T C-3,3,-C T T A A G-5,)切点大多数在识别顺序之内,也有例外,)限制酶切后产生两个末端,末端结构就是,-,与,-,2、,末端种类,),-,端突起,个数为或个核苷酸,Pst,I,5,-CTGCAG-3,5,-CTGCA G-3,3,-GACGTC-5,3,-G ACGTC-5,),-,端突起,个数为或个核苷酸,Eco,RI 5,-GAATTC-3,5,-G,OH,P,AATTC-3,3,-CTTAAG-5,3,-CTTAA,P,HO,G-5,粘性末端能与另一个相同得粘连末端相连接,任何两个具有相同识别位点得,DNA,分子经限制酶切割后能够重新连接成新得重组,DNA,分子。在进行,DNA,重组时,应用限制酶同时切割目得基因与载体,DNA,使之产生相对得粘性末端,然后再将二者连接成重组,DNA,分子,),平齐末端,Sma,I 5,-CCCGGG-3,5,-CCC GGG-3,3,-GGGCCC-5,3,-GGG CCC-5,)非互补得粘性末端,)切点在识别顺序之外得,如:,Fok,I,Fok,I 5,-GGATG(,),9,-3,5,-GGATG(N),9,3,-CCTAC(,),13,-5,3,-CCTAC(N),13,)能识别简并顺序得,如:,Ava,I,Ava,I,5CPyCGPuG-3,CCCGGG,;C TCGGG;CCCGAG;,CTCGAG,5,-,GAATTC,-,3,3,-,CTTAAG,-5,5,-,GTTAAC,-,3,3,-,CAATTG,-5,EcoR,得识别序列,Hae,得识别序列,5,NNNNNNN,GAATTC,NNNNNNNN,3,3,NNNNNNN,CTTAAG,NNNNNNNN,5,5,NNNNN,G,3,NNNNN,CTTAAp,EcoR,得识别序列与酶切切口(粘端),pAATTC,NNNNNN,3,G,NNNNNN,5,5,NNNNNN,GTTAAC,NNNNN,3,3,NNNNNN,CAATTG,NNNNN,5,5NNNNN,GTT pAAC,NNNNN,3,3,NNNNN,CAAp TTG,NNNNN,5,Hae,得识别序列与酶切切口(平端),酶切条件:酶切缓冲液,低盐组:,0,50mmol/L NaCl,中盐组:,50,100mmol/L NaCl,高盐组:,100,150mmol/L NaCl,(四)、异源同序酶(,isoschizomer,同裂酶),1、,定义:能识别相同序列但来源不同得两种或多种限制 酶,2、,特点:,1,)识别相同顺序,2,)切割位点得异同,Kpn,I GGTAC C,Asp,718 G GTACC,Sst,I CCGC GG,Sac,I CCGC GG,大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,(五)、限制酶得用途,1、,DNA,重组,2、,限制酶(物理)图谱绘制,3、,突变分析(,RFLP,分析),4、,限制酶得部分酶切与完全酶切,附:,IIS,型限制酶得特点,1、,具有特异型核苷酸顺序识别能力,但该顺序不具有对称结构。,2、,酶切位点与识别位点不一致,切点常在识别位点得一侧,1-20nt,。,3、,酶切后得末端经补平后又可发生酶切反应。,4、,产生粘性末端可以就是,1-5,个核苷酸。,5、,均为单体,分子量为,47,108 kD,。,酶切图谱得构建(,a,),请构建该环状,DNA,分子得酶切图谱,酶切图谱得构建(,b,),二、,DNA,甲基化,酶,(,一)甲基化酶得种类与识别顺序,1、,限制修饰系统,I,、,II,、,III,型中得甲基化酶,三个系统中得甲基化酶可使细菌,DNA,分子中得胞嘧啶与腺嘌呤发生甲基化,形成,5,-,甲基胞嘧啶与,6,-,甲基腺嘌呤。,在,DNA,重组实验中,常用得甲基化酶属于,II,型,它与相应得限制酶得识别顺序相同,其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。,如:,M、EcoRI GA,m,ATTCC,Eco,RI G AATTC,不同,M,、,HpaI C,m,CGG,Hpa,I C CGG,相同,2、,II,型甲基化酶对限制酶活性得影响,),抑制同种限制酶得活性,M、BamHI GGAT,m,CC,Bam,HIG,GATCC),M、EcoRI GA,m,ATTC,Eco,RI(G,AATTC),),抑制不同种限制酶得活性,a、,顺序完全重叠 如:,M、ClaI,(,ATCG,m,AT,),-,Taq,I,(,TCG,m,A,),b、,顺序边界重叠 如:,M、BamHI,(,GGAT,m,CC,),-,Mep,I,(,m,CCGG,),),抑制不同种限制酶得部分活性,M,、,TaqI,(,TCG,m,A,),-,Hin,dII,(,GTPyPuAC,):,GTCAAC,GTTAAC,GTCG,m,AC,GTTGAC,3、,甲基化酶得用途,),改变某些限制酶识别顺序得特异性,以便重组体得形成,),在建立基因文库时,可先使,DNA,分子部分甲基化,然后再用限制酶切,M.RE,CH,3,CH,3,CH,3,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,CH,3,CH,3,CH,3,与载体相连,甲基,化酶,人工,接头,RE,用于基因组文库的建立,用于,cDNA,的连接,RE,RE,RE,三、核酸酶,(,一)、外切酶,III,(,ExoIII,),1、,一般特点:,来自于,E、coli,分子量,28,000 kD,2、,催化反应类型,1),外切酶活性:,3,5,产生,5,-,单磷酸核苷酸与具各种结构得,ds-DNA,pH 7、6-8、5,2),核酸酶,H,活性:除去,DNA-RNA,杂交分子中得,RNA,分子,pH 7、6-8、5,3)3,-,磷酸酶活性:除去,3,-,磷酸基后形成,3,-OH,端,有利于,DNA,聚合酶反应,pH 6、8-7、4,4),内切酶活性:在无嘌呤或无嘧啶处将,DNA,键切开,pH 7、6-8、5,3、,外切酶活性特点,1),反应底物:互补,ds-DNA,2),碱基释放速度:,CA-TG,3),反应产物:,5,-,单磷酸核苷与具缺口或,5,-,端突起得,ds-DNA,过度反应将导致,DNA,降解,4、,用途,1),核酸(,DNA,)标记,2),基因突变,-,缺失,3),DNA,序列测定时作顺序缺失,5、,使用注意事项,1),正式使用前,测定在一定条件下酶得反应速度,2),在一定条件下,ExoIII,不能作用,GC,富集区,(,来自于,cDNA,加尾,),ds-DNA,结构,:,切口,缺口,断口,缺口,(gap),切口,(nick),断口,(cut),3,HO P5,3,HO P5,5,P,5,P,5,P,5,P,5,P,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,OH3,OH3,OH3,OH3,P5,P5,P5,P5,P5,P5,P5,3,HO,P5,OH3,P5,RNaseH,ExoIII,得外切酶与,RNaseH,得作用,1 2 3 4 a b c,1 2 3 4 a b c,1 2 3 4 a b c,1 2 3 4 a b c,1 2 3 4 a b c,2 3 4 a b c,3 4 a b c,4 a b c,a b c,ExoIII,用于顺序缺失,ExoIII,ExoIII,-,32,P,-,32,P,dCTP,dCTP,5,P,P5,5,P,P5,3,HO,OH3,3,HO,OH3,ExoIII,用于,DNA,标记,(二)、,RNase,(三)、,RNaseH,(二)、,RNase,大部分用于,RNA,得核苷酸序列分析或除去,DNA,样品或蛋白质合成系统中得,RNA,分子。,1、RNase A,分离自牛胰脏,对热稳定,抗去污剂(,100,加热,15min,仍具活性)用于除去,DNA,样品中得,RNA,分子,2、,核酸酶,S7,亦称微球菌核酸酶,对,RNA,敏感,用于除去蛋白质合成系统中得内源,mRNA,(三)、,RNase H,作用于,DNA-RNA,杂交分子中得,RNA,链,用于,cDNA,文库建立时除去,R,NA,链以便第二条链,cDNA,链得合成。,(四)、,DNase I,1、,特点:,具内切酶活性,作用于,ds-DNA,但无核苷酸序列特异型,产生,5,-P,低聚核苷酸,;Ca,2+,Mg,2+,或,Ca,2+,Mn,2+,可使酶活达最大值,当酶浓度很低时,ds-DNA,分子上将形成切口,不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响:,Mg,2+,存在时,两条链上得切口独立无关,Mn,2+,存在时,两条链上得切口几乎在同一位置,2、,用途,1),切口移位,制备,DNA,探针,2),制备,RNA,样品时除去,DNA,分子,3),基因突变时产生切口,Mn,+,存在时,Mg,+,存在时,DNaseI,作用特点,DNaseI,HO P,5 3,5 3,5 3,DNaseI,与,Pol I,的,切口移位,Pol I,四、聚合酶,包括,DNA,聚合酶与,RNA,聚合酶,(一)、,E,、,coli,DNA,聚合酶,I,(,polI,),1、,E、coli,得,DNA,聚合酶系统,Pol I,参与,DNA,修复,具,3,5,与,5,3,外切酶活性,pol II,同上 具,3,5,外切酶活性,pol III,参与,DNA,复制,具,3,5,与,5,3,外切酶活性,2、,E、coli,polI,得特点,1,)具两种外切酶活性与,DNA,聚合酶活性,在蛋白酶作用下,该酶分裂成两个大小不同得片段,其中小片段具,5,3,外切酶活性,大片段具,3,5,外切酶活性,(,大片段亦称为,Klenow,片段,polIK),2,)聚合酶活性,5,3,要求,3,-OH,引物与模板,DNA,其延续性受反应条件得影响,3,)外切酶活性,3、,用途,1,)除去,3,-,端突起得单链,DNA,(在无,dNTP,时),2,)补齐,5,-,突起端,3,)合成第二条,cDNA,4,)切口移位制备探针 其中用途,2),与,3),常用大片段,(二)、,T4 DNA,聚合酶,1、,特点:,5,3,聚合酶活性,1500 nt/min,为,pol I,得两倍,3,5,外切酶活性,可作用于,ss-DNA,与,dsDNA,其切除速度分别为,40,与,4000nt/min,缺少,5,到,3,得外切核酸酶活性,、,2、,用途:,制备高比活性探针,(10,10,cpm/gDNA);DNA,末端修饰,-,缺失,外切酶活性,聚合酶活性,无,dNTP dNTP,(,三,)T7,噬菌体,DNA,聚合酶,具,3,到,5,端外切核酸酶活性与持续合成能力较低得,DNA,聚合酶活性,、,应用1),合成,DNA,能力很强,可用于延伸很长得模板,、,2),可用于定点诱变中互补链得合成,、,3)3,末端得标记,4),将双链,DNA,得黏性末端转变为平端,、,(四)、,Taq DNA,聚合酶,1、,特点:,分离自水生栖热菌,分子量为,94,000,最适反应温度,75,对,95,高温具良好稳定性,该酶不存在,3,5,外切酶活性,2、,用途:,主要用于,DNA,得体外扩增,经,25,次循环后才进入酶得反应稳定期,一个,DNA,分子因而可被扩增,410,6,倍。,DNA,扩增技术又称为聚合酶链式反应,它包括以下三个步骤:,DNA,模板变性,(95,),与,DNA,引物退火,(45,),引物延伸,(75,),Taq Pol,与,PCR,5 3,变性,3 5,5 3,引物,3 5,复性,5 3 5 3,3 5,引物,3 5,5 3,延伸,5 3,3 5,3 5,(,五,),不倚赖于模板得,DNA,聚合酶,末端转移酶,特点,:,催化,dNTP,到,DNA,得,3,羟基端,不需要模板,但需要,2,价阳离子,、,应用,:,1),克隆,DNA,片段,、,同聚物加尾,、,2),用,32,P,标记,DNA,得,3,末端,、,3),在,DNA,得,3,末端掺入非放射性得标签,、,4),合成多脱氧核苷酸同聚体,、,(,六,),倚赖,RNA,得,DNA,聚合酶,反转录酶,合成,cDNA,克隆,补平与标记,5,端突出得,DNA,片段得,3,末端,、,代替,Klenow,酶,(,七,),倚赖,DNA,得,RNA,聚合酶,噬菌体得,RNA,聚合酶,:SP6,T7,与,T3,应用,:,产生均匀标记得高比活性单链,RNA,探针,(,原位杂交,),(,八,),不倚赖,DNA,得,RNA,聚合酶,poly(A),聚合酶,应用,:,用,32,P,标记,RNA,得,3,端,加尾,(poly(A),