蛋白质组学PPT.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Proteomics,蛋白质组学,“Proteomics includes not only the,identification,and,quantification,of proteins,but also the determination of their localization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,their function.”,-Stan Fields in,Science,2001.,什么是蛋白质组学,Genomics,Transcriptomics,Proteomics,什么是蛋白质组学,基因组学,研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析（后基因组学）的遗传学分支。,转录组学是一门研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科。,不是十万个,Cataloguing Proteomics,Protein catalogue-what proteins are there in a cell,tissue,organelle,etc.,Expression proteomics,:,analysis of differential protein expression,Functional proteomics,:,posttranslational modifications,protein-protein,protein-ligand interactions,sequence-structure-function relationships,蛋白质组学传达了什么信息？,特定细胞组织中的任意时间存在的全部蛋白；,蛋白蛋白相互作用的大规模研究；,提供医学诊断和预防的新途径（例：体液蛋白质分析）；,补充现有医学技术，如：免疫蛋白质组学，了解药物的作用及副作用；,宏蛋白质组学：鸟枪法分析微生物物种混合物。,尚未清楚？,低丰度、质量大、极酸、碱性蛋白检测,样品分级；,蛋白相互作用组不可能比较,-,蓝绿温和胶电泳法；,无法实时监测蛋白质组变化,-,高倍率显微镜活细胞分析；,半定量；,产生普通型和标准型蛋白质组数据；,需采用先进的统计学方法进行数据分析；,数据解释仍是瓶颈问题。,蛋白质组学技术,蛋白质鉴定,比较蛋白质组学,质谱鉴定蛋白质的原理及具体流程,双向凝胶电泳,初分离技术,-SDS-Page,antibody column,PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF,双向差异凝胶电泳,(DIGE),同位素标记技术,数据分析软件,(Sequest,X!tandem,TPP),数据验证,无标记定量技术,Quantitative Proteomics,Gel-based,MS-based,Gel Based Techniques,1D Gel Analysis,1D Gel Analysis,Strengths:,Simple,In expensive sample,prep,Membrane proteins,High MW proteins,(100 kDa),Limitations:,Limited resolution,Low MW Proteins,(Protein A,acedfhsakdfqea,sdfpkivtmeeewe,ndadnfekqwfe,Protein B,acekdfhsadfqea,sdfpkivtmeeewe,nkdadnfeqwfe,Protein C,acedfhsadfqeka,sdfpkivtmeeewe,ndakdnfeqwfe,Sequence,Mass(,M+H,),Tryptic Fragments,4842.05,4842.05,4842.05,acedfhsak,dfgeasdfpk,ivtmeeewendadnfek,gwfe,acek,dfhsadfgeasdfpk,ivtmeeewenk,dadnfeqwfe,acedfhsadfgek,asdfpk,ivtmeeewendak,dnfegwfe,PMF,如何产生,Protein A,acedfhsakdfqea,sdfpkivtmeeewe,ndadnfekqwfe,Protein B,acekdfhsadfqea,sdfpkivtmeeewe,nkdadnfeqwfe,Protein C,acedfhsadfqeka,sdfpkivtmeeewe,ndakdnfeqwfe,Sequence,Mass(,M+H,),Mass Spectrum,4842.05,4842.05,4842.05,构建理论上,PMF,数据库,Protein A,acedfhsakdfqea,sdfpkivtmeeewe,ndadnfekqwfe,Protein B,acekdfhsadfqea,sdfpkivtmeeewe,nkdadnfeqwfe,Protein C,acedfhsadfqeka,sdfpkivtmeeewe,ndakdnfeqwfe,Sequence DB,Calc.,Tryptic Frags,Mass List,acedfhsak,dfgeasdfpk,ivtmeeewendadnfek,gwfe,acek,dfhsadfgeasdfpk,ivtmeeewenk,dadnfeqwfe,acedfhsadfgek,asdfpk,ivtmeeewendak,dnfegwfe,1007.4251(,A-1,),1112.4894(,A-2,),2098.8909(,A3,),538.2296 (,A-4,),450.2017 (,B-1,),1740.7500(,B-2,),1407.6462(,B-3,),1300.5116(,B-4,),1526.6211(,C-1,),664.3300 (,C-2,),1593.7101(,C-3,),1114.4416(,C-4,),实验,(MALDI)Spectrum,698,2098,1199,1007,538,450,m/z,Abundance,实验谱图,vs.,理论谱图,Query Masses,Database Mass List,Results,450.2017 (B),538.2296 (A),664.3300 (C),1007.4251(A),1112.4894(A),1114.4416(C),1300.5116(B),1407.6462(B),1526.6211(C),1593.7101(C),1740.7501(B),2098.8909(A),450.2201,538.2296,698.3100,1007.5391,1199.4916,2098.9909,2 Unknown masses,1 hit on B,3 hits on A,Conclude the query,protein is A,基于,PMF,鉴定蛋白质,实验质谱图谱,蛋白酶或酶切位点,已知蛋白质数据库,修饰位点及基团质量,图谱匹配质量判断,质量误差阈值,(,100,ppm,=1000.0,0.1,Da,),常用软件,(,Prowl,ProFound,Mascot,PepIdent,),预测蛋白,PI,和质量，预判蛋白在胶内位置,Challenge 1:,质量非唯一性,Gly+Gly=114.043 -Asn=114.043,Ala+Gly =128.059 -Gln=128.059,-Lys =128.095,Gly+Val=156.090 -Arg=156.101,Ala+Asp=Glu+Gly=186.064,Trp=186.079,Ser+Val=186.100 -Trp=186.079 u,Leu=Ile=113.084,Challenge 2:,酶切不完全,Protein A,acedfhsakdfqea,sdfpkivtmeeewe,ndadnfekqwfe,Sequence,Tryptic Fragments(,no missed cleavage,),acedfhsak (1007.4251),dfgeasdfpk (1183.5266),ivtmeeewendadnfek (2098.8909),gwfe (538.2296),Tryptic,Fragments(,1 missed cleavage,),acedfhsak (1007.4251),dfgeasdfpk (1183.5266),ivtmeeewendadnfek (2098.8909),gwfe (538.2296),acedfhsakdfgeasdfpk (2171.9338),ivtmeeewendadnfekgwfe (2689.1398),dfgeasdfpkivtmeeewendadnfek (3263.2997),PMF,鉴定,法优,缺,点,使用,2DE-MALDI-TOF,，费用低廉,所鉴定蛋白质序列必须已知,不适用于,3,种蛋白以上的混合物,敏感性不够，肽段缺失导致没有结果,精确性不高,2DE,中只有大约,40%,的点能得到鉴定,常用的质量纹算法,现在试验中可用的算法有：,Mascot:,Profound:,prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/Profound,Expasy tools:,www.expasy.ch/tools/,PeptideSearch:,mac-mann6.embl-heidelberg.de,PMF,中的问题,第一个问题：质量相近的多肽怎么处理？,在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近的多肽。这样，就造成了质谱图上的一个峰可能匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这张质谱图究竟代表哪个蛋白。,质量相近的多肽,多肽,M+H+,DGAPLESSSR,1019.0490,REGESTPSR,1019.0520,DFPIANGER,1019.0940,DPLASSSWR,1019.0940,YVPLKDQR,1019.1800,HLQLPAPSR,1019.1830,VLFLNGIDK,1019.2200,Peak m/z:1019.08,解决方案,第一个解决的办法是限制用来搜索的数据库。比如，你如果做的试验用的是小白鼠的组织，那么你可以只在鼠类的数据库中搜索，这样就可以减低出现这种情况的可能性。,第二个解决的办法是要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。,多匹配,DFPIANGER 1019.09,EPISVSSQQMLK 1347.56,VLDALDSIK 97413,Carbonic anhydrase II,SHHWGYGKHBGPZHWHKDFPIANGERQSPVNIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVN,NGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSBBQGSEHTVDRKKYAAELHLV,HWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPG,SLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLML,ANWRPAQPLKNRQVRGFPK,多匹配可以大大降低随机匹配的概率,从而增加结果的可信度,长蛋白和短蛋白,第二个问题：长蛋白可能会更容易的被匹配。,因为长蛋白里的多肽数目较多，即以概率来算，匹配上的几率也会比较大。,质量纹算法必须考虑这个问题，给短蛋白一定的补偿。,多个蛋白的情况,第三个问题就是在一张质谱图中可能有多个蛋白存在。,通常，,MALDI-TOF,是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有,2-3,个蛋白，这样就增加了鉴定的难度。,由于无法预知一个电泳点上有多少蛋白质，,PMF,的效果可能会受到很大的影响。,多肽质量纹：小结,质量纹算法是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法。,质量纹算法比较简单，一般使用较简单的统计模型，速度一般较快质量纹算法的效果受到很多方面的限制，首先是仪器精度的限制，其次是样品中可能有多个蛋白的限制。这使得质量纹算法不是理想的分析复杂混合物中蛋白成分的方法。,基于质谱蛋白质鉴定方法,一级质谱仪,(,Mass Spectrometry),肽指纹图谱,(,Peptide Mass Fingerprinting,),串联质谱仪,(,Tandem Mass Spectrometry),图谱比对,(,Spectral alignment),从头测序,(,de novo,sequencing),统计分析,(,Statistical validation),蛋白质组学串联质谱数据分析流程,利用二级质谱图,我们刚才谈到了，多肽质量纹有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能处理多个蛋白的混合物。,如果我们能够处理混合物，就可以减少很多用于纯化上的时间和精力。,那么，怎么才能从混合物中鉴定蛋白呢？这就要用到二级质谱。,串联质谱,蛋白质组学串联质谱实验流程,CID,CID,，即,Collision-induced Dissociation,，是通过撞击使得多肽的肽键断裂的过程。,在做二级质谱的试验时，质谱仪选择一级质谱中的一个峰，也就是对应质荷比的这些离子，让这些离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，这就是,CID,。,二级质谱图,在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行,CID,过程，就得到一张二级质谱图。,这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽，实际情况可能并不是这样。,对于一张一级质谱图，可以选择多个峰进行二级质谱的操作。这样就可以适应一张质谱图里有多个蛋白的情况。,典型二级质谱图,m/z:,质量电荷比,APNDFNLK,蛋白质组学串联质谱数据分析流程,蛋白质组学串联质谱数据分析流程,肽键及其断裂,m/z:,质量电荷比,蛋白质组学串联质谱数据分析流程,一些常见的特殊情况,除了普通的肽键断裂以外，还经常有一些特殊的情况。,Neutral loss:,某些酸性氨基酸可能会在,CID,中丢失一个水分子（,H,2,O,），而碱性氨基酸会在,CID,中丢失一个氨分子（,NH,3,）翻译后修饰：有时，二级质谱中需要考虑某些氨基酸可能被修饰（磷酸化、糖基化等），这些修饰可能改变残基的分子量。,肽键断裂的说明,CID,中，肽键的断裂方式有非常多的可能性。关于具体的断裂方式，可以去查询生物化学方面的书籍。这些问题超过了本课程的范围。,通常，我们只考虑,b,系列和,y,系列。原因是我们使用的电压较低，其他系列的离子不易产生。,但实际上，如果能够清楚的知道我们究竟需要考虑什么样的断裂方式，对搜索算法的设计会有很大的帮助。,v,1-,letter,code,Average,mass,Alanine,A,71.08,Arginine,R,156.19,Asparagine,N,114.10,Aspartic acid,D,115.09,Asn or Asp,B,Cysteine,C,103.14,Glutamic acid,E,129.12,Glutamine,Q,128.13,Glu or Gln,Z,Glycine,G,57.05,Histidine,H,137.14,Isoleucine,I,113.16,Leucine,L,113.16,Lysine,K,128.17,Methionine,M,131.19,Phenylalanine,F,147.18,Proline,P,97.12,Serine,S,87.08,Threonine,T,101.10,Selenocysteine,U,150.03,Tryptophan,W,186.21,Tyrosine,Y,163.18,Valine,V,99.13,蛋白质组学串联质谱数据分析流程,IPI:IPI00000005.1|VEGA:OTTHUMP00000013879 Tax_Id=9606 Gene_Symbol=NRAS GTPase NRas precursorMTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLPTRTVDTKQAHELAKSYGIPFIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQYRMKKLNSSDDGTQGCMGLPCVVMIPI:IPI00000006.1|VEGA:OTTHUMP00000162769;OTTHUMP00000166055 Tax_Id=9606 Gene_Symbol=HRAS GTPase HRas precursorMTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQHKLRKLNPPDESGPGCMSCKCVLS,Name of the sequence Sequence,Example(open with notepad):,Database format(.fasta),www.ebi.ac.uk/IPI/,蛋白质组学串联质谱数据分析流程,蛋白质组学串联质谱数据分析流程,68000*50,理论图谱,3000,实验图谱,VS,蛋白质组学数据分析软件,X!tandem,OMSSA,Sequest,Mascot,类型,开源软件,开源软件,商业软件,商业软件,数据输入,DTA,PKL,MGF,mzXML,DTA,PKL,MGF,mzXML,RAW,DTA,MGF,DTA,并行运算,支持（,PVM,MPI,）,支持（,MPI,）,支持（,PVM,）,支持（,MPI,）,16 Nodes in-house Linux Cluster,32 Xeon CPU,14.5TB storage server,高性能集群计算机,(HPC),Hangzhou National software center,512 CPU,蛋白质组学数据分析软件,基于质谱蛋白质鉴定方法,一级质谱仪,(,Mass Spectrometry),肽指纹图谱,(,Peptide Mass Fingerprinting,),串联质谱仪,(,Tandem Mass Spectrometry),图谱比对,(,Spectral alignment),从头测序,(,de novo,sequencing),统计分析,(,Statistical validation),De-novo Sequencing,这种通过残基来鉴定多肽的方法被称为,De-novo Sequencing,。,当我们拥有近乎完美的二级质谱图时，我们可以采用这种,De-novo Sequencing,的办法。,但是，实际情况中，我们并没有完美的二级质谱图，而一点点的不完美，带来的误差是惊人的。,氨基酸质量表,Molecular weights used for calculations.,Buttoncode,Shortcode,Name,Average massof residue,Monoisotopic,mass of residue,Twenty Naturally-Occurring Amino Acids,Ala,A,Alanine,71.0788,71.03711,Cys,C,Cysteine,103.1448,103.00919,Asp,D,Aspartic Acid,115.0886,115.02694,Glu,E,Glutamic Acid,129.1155,129.04259,Phe,F,Phenylalanine,147.1766,147.06841,Gly,G,Glycine,57.0520,57.02146,His,H,Histidine,137.1412,137.05891,Ile,I,Isoleucine,113.1595,113.08406,Lys,K,Lysine,128.1742,128.09496,Leu,L,Leucine,113.1595,113.08406,Met,M,Methionine,131.1986,131.04049,Asn,N,Asparagine,114.1039,114.04293,Pro,P,Proline,97.1167,97.05276,Gln,Q,Glutamine,128.1308,128.05858,Arg,R,Arginine,156.1876,156.10111,Ser,S,Serine,87.0782,87.03203,Thr,T,Threonine,101.1051,101.04768,Val,V,Valine,99.1326,99.06841,Trp,W,Tryptophan,186.2133,186.07931,Tyr,Y,Tyrosine,163.1760,163.06333,组合数,(,估计值）,峰间质量距离,(Da),最低组合数,最高组合数,平均值,50-100,0,1,0.089,100-200,0,14,1.556,200-300,1,136,24.871,300-400,37,1687,386.23,400-500,586,23481,5958.36,500-600,14093,340380,92016.7,600-700,248521,4873260,1418510,Database Searching,对于一张不完美的质谱图，有这么多的组合可以生成之。但是，幸运的是，我们还有这个蛋白序列数据库。,虽然组合有那么多，但是在这个数据库的限制之下，组合数就大大的减少了。,所以我们可以从数据库里搜索最好的匹配质谱图的多肽，这样就有了二级质谱的数据库搜索算法。,数据库搜索的基础,数据库搜索的基础很简单，就是理论质谱图和试验质谱图之间的一个比对。,我们刚才讨论了,CID,的过程，所以我们知道了残基产生的规律，那么，利用这些规律，我们可以对每个多肽产生一张理论的质谱图，用来和试验质谱图进行比对，对它们“相似”的程度做一个评分，分数最高的多肽，我们就认为它是试验质谱图代表的多肽。,理论质谱图和试验质谱图,图谱峰之间的质量差对应相应氨基酸残基质量,s,s,s,e,e,e,e,e,e,e,e,q,q,q,u,u,u,n,n,n,e,c,c,c,基于质谱蛋白质鉴定方法,数据库检索,VS,de novo,预测,W,R,A,C,V,G,E,K,D,W,L,P,T,L,T,W,R,A,C,V,G,E,K,D,W,L,P,T,L,T,de novo,AVGELTK,Database Search,Database ofknown peptides,MDERHILNM,KLQWVCSDL,PTYWASDL,ENQIKRSACVM,TLACHGGEM,NGALPQWRT,HLLERTKMNVV,GGPASSDA,GGLITGMQSD,MQPLMNWE,ALKIIMNVRT,AVGELTK,HEWAILF,GHNLWAMNAC,GVFGSVLRA,EKLNKAATYIN.,数据库检索,VS,de novo,预测,Advantage,:,用于检测未知蛋白序列和不确定,PTM,无需扫描蛋白数据库，速度较快,Disadvantage,:,对质谱图谱质量要求比较高,正确性不高,de novo,预测的正确性,肽段序列完全正确的少于,30%,Algorithm,Amino Acid Accuracy,Whole Peptide Accuracy,Lutefisk,1997,0.566,0.189,SHERENGA,1999,0.690,0.289,Peaks,2003,0.673,0.246,PepNovo,2005,0.727,0.296,基于质谱蛋白质鉴定方法,一级质谱仪,(,Mass Spectrometry),肽指纹图谱,(,Peptide Mass Fingerprinting,),串联质谱仪,(,Tandem Mass Spectrometry),图谱比对,(,Spectral alignment),从头测序,(,de novo,sequencing),统计分析,(,Statistical validation),不同软件有不同判定标准,9%,19%,7%,34%,5%,4%,22%,Mascot,Each search engine identifies about the same number of spectra,But the overlap is surprisingly small.,Different search engines match different spectra.,SEQUEST,X!tandem,不同软件有不同判定标准,如何进行可靠性的统计分析,TPP,（,Trans-Proteomic Pipeline,）,tools.proteomecenter.org/TPP.php,蛋白质组学质谱数据分析流程,定量蛋白质组学,代谢标记,假设来写一两本书,S,table,I,sotope,l,abeling with,a,mino acids in,c,ell culture(SILAC),细胞培养液中去除天然精氨酸和赖氨酸,替代以轻重同位素标记的精氨酸和赖氨酸,(,13,C,6,15,N,4,Arginine,and,13,C,6,Lysine,),或其他氨基酸；,使用去除游离氨基酸的血清,体内标记，更彻底高效,无需化学标记物,无需亲和纯化,在细胞培养的同时完成标记,优势,:,细胞中,Leu-d3,丰度改变,Doubling time of the cells is 24 hrs.,Peptide=VAPEEHPVLLTEAPLNPK,SILAC,Media no Lys and Arg,FCS dialyzed to remove free amino acid,Heavy Lys,Arg or both,Unmodified amino acid,3,化学标记,Isotope Coded Affinity Tags(ICAT),Biotin tag,Linker(d0 or d8),Thiol specific reactive group,ICAT Reagents:,Heavy reagent:d8-ICAT(X=deuterium),Normal reagent:d0-ICAT(X=hydrogen),S,N,N,O,N,O,O,O,N,I,O,O,X,X,X,X,X,X,X,X,Han,D.K.,Eng,J.,Zhou,H.and Aebersold,R.(2001)Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.,Nat Biotechnol,19,946-951.,Combine and proteolyze,Affinity separation,Quantitation and protein identification,ICAT-labeled cysteines,550,560,570,580,m/z,0,100,200,400,600,800,m/z,0,100,NH,2,-EACDPLR-,COOH,Light,Heavy,Mixture 2,Mixture 1,Optional fractionation,Protein Quantification&Identification,Ion exchange,LC-MS/MS,Enrich for membrane proteins,Or Isolate Protein Complexes,LC-MS/MS,Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,分流器,LC-MS/MS,单次实验能同时扫描,，鉴定并定量,几百个蛋白；,节省样品准备工作，相对二维电泳能节省时间和花费；,具有更好的,敏感性和精确性；,能实现自动化的,高通量实验,流程；,同位素标记法定量,轻重同位素标记的肽段在质谱图谱中会生成两个信号峰,对肽段的定量是通过定量该肽段的单离子峰图的丰度,M/Z,light,heavy,标记物能与蛋白质普遍结合,标记效率要高,标记物有很好的稳定性,标记物不能抑制样品离子化和碎片化,轻重标记物有一定的质量差异,轻重标记物能同时从色谱柱上洗脱下来,同位素标记,没有半胱氨酸,ICAT,的反应基团不能连上半胱氨酸,蛋白修饰影响,基团碎片化,只能两两比较,ICAT,的不足之处,ITRAQ,（,isotope Tags for Relative and Absolute Quantitation,）,可同时对四个样品进行标记做定量分析，最近又推出可同时标记,8,个样本标记的,ITRAQ,技术；该试剂分子有三个部分组成，报告基团，用于定量，其分子量分别由,114-117,逐一增加；平衡基团，用于平衡报告基团带来的分子量的差异；反应基团，与氨基酸的,N,末端反应结合。前体肽段被二级质谱选择后被,CID,打碎，形成的,b,离子和,y,离子用于蛋白的定性，被打断游离出的报告基团用于定量。,附表：,质谱标记定量数据分析软件,软件名称,适用范围,软件名称,适用范围,ASAPRatio,ICAT,cICAT,SILAC,Multi-Q,iTRAQ,XPRESS,ICAT,Cicat,SILAC,N14/N15,muxQuant,ICAT,Cicat,SILAC,N14/N15,Libra,iTRAQ,PVIEW,SILAC,IACT,非标记定量,MaxQuant,SILAC,Quant,iTRAQ,MFPaQ,ICAT,SILAC,QUIL,ICAT,Cicat,SILAC,O16/O18,MSQuant,ICAT,Cicat,SILAC,N14/N15,RAAMS,O16/O18,WaveletQuant,ICAT,cICAT,SILAC,单离子峰图,LC-MS/MS,单离子峰图,Fan Mo et al.,BMC bioinfomatics,2010,单离子峰图定量,PPT,纲要,蛋白质鉴定,比较蛋白质组学,质谱鉴定蛋白质的原理及具体流程,双向凝胶电泳,初分离技术,-SDS-Page,antibody column,PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF,双向差异凝胶电泳,(DIGE),同位素标记技术,数据分析软件,(,Sequest,X!tandem,TPP),数据验证,无标记定量技术,基于肽段的单离子峰强度的方法,基于蛋白的对应肽段个数的方法,1.,峰信号的计算,2.,峰信号滤噪处理,3.,峰面积的计算以及差异定量,这个过程一般由计算机软件来完成,Lable,free,软件名,操作系统,仪器,数据格式,二级谱图,开源软件,SpecArray,Linux,FT-LTQ,OrbiTrap,Qtof,mzXML,否,是,MsInspect,Linux,OSX,Windows,ESI-,Tof,OrbiTrap,FT-LTQ,Qtof,mzXML,，,raw,是,是,MSight,Windows,LTQ,FT-,LTQ,Qtof,mzXML,是,是,TOPP,Linux,OSX,LTQ,ESI-,Tof,mzXML,是,是,PEPPeR,Linux,OSX,Windows,FT-LTQ,OrbiTrap,mzXML,是,是,SuperHirn,Linux,OSX,FT-LTQ,OrbiTrap,Qtof,mzXML,是,是,QuanLynx,Windows,Waters,raw,是,否,SIEVE,Windows,ThermoFinnigan,raw,是,否,Elucidator,Windows,FT-LTQ,OrbiTrap,Qtof,raw,是,否,PPT,纲要,蛋白质鉴定,比较蛋白质组学,质谱鉴定蛋白质的原理及具体流程,双向凝胶电泳,初分离技术,-SDS-Page,antibody column,PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF,双向差异凝胶电泳,(DIGE),同位素标记技术,数据分析软件,(Sequest,X!tandem,TPP),数据验证,无标记定量技术,12,种常见蛋白质占血清蛋白的,9,6,Albumin,IgA,IgG total,IgM,Pool Containing Medium-&Low-Abundance Proteins,Transferrin,Fibrinogen,a,2-Macroglobulin,a,1-Antitrypsin,Haptoglobin,Apolipoproteins A-1&A-II,a,1-Acid Glycoprotein,血液蛋白质组学分析的挑战,血液蛋白质的动态范围极大,22,种常见蛋白质占血清蛋白的,99,，低丰度的蛋白质会被由优势蛋白所掩盖。而正是这些低丰度的蛋白能够提供可能鉴别疾病的关键多维参数。,MS:10,4,定量范围,初分离,-,抗体柱,SDS-page LC-MS/MS,In-Gel trypsin digestion,LC-MS/MS,PPT,纲要,蛋白质鉴定,比较蛋白质组学,质谱鉴定蛋白质的原理及具体流程,双向凝胶电泳,初分离技术,-SDS-Page,antibody column,PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF,双向差异凝胶电泳,(DIGE),同位素标记技术,数据分析软件,(Sequest,X!tandem,TPP),数据验证,无标记定量技术,Multi-dimensional Chromatography,strong cation exchange(,SCX,)and,reversed phase,chromatography(,RP,).,Summary of Multi-Dimensional Chromatography,Strengths:,Reduces sample complexity,Low abundance proteins,Membrane proteins,All MW Proteins,Flexible(different column,combinations),Can automate,Limitations:,Complex setup,No faster than 2D gels,Computer intensive,Not Quantitative,Reproducibility,Mass Spectrometry BasedTechniqueswithStable Isotopes or MassTags,Absolute Quantification(AQUA)Scheme,18,O-labeling Protocol,Quantify by,18,O to,16,O peptide ratios,Strengths/Limitations of,18,O-Labeling,Strengths:,No extra steps,Relative quantification using,multiple peptides from same protein,Post-transla