血涂片制备和染色.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,血液一般检验,主讲人:李学民,1,.,复习 血液标本采集和抗凝剂选择,血标本：,全血：血细胞+血浆;临床血液学检查，血细胞计数、分类和形态 学检查,血浆：全血除去血细胞；血浆病理性和生理性化学成分的测定，内分泌激素、凝血因子（钙除外）、血栓和止血检查,血清：离体后血液自然凝固后析出的液体成分（除,纤维蛋白原,等凝血因子）；临床化学和临床免疫学检查，,可见血浆与血清的主要区别是，血清中不含纤维蛋白原。,2,.,一、采血方法,静脉采血法,部位：主要是肘静脉。,还可以在：手背、内踝、股静脉，幼儿可采用颈外静脉采血,注意事项:,抽血时只能外抽不能内推，以免形成空气栓塞,3,.,4,.,部位：WHO推荐中指或无名指尖内侧为宜,，耳垂采血受温度影响大；半岁以下拇指或足部，特殊人员视情况而定。,采血步骤及注意事项：应严格实行一人一针制；穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。用消毒干棉球擦去第一滴血，以后流出的血液可以使用。,皮肤采血法（毛细血管采血法）,5,.,二、抗凝剂选择,抗凝：用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固,抗凝剂：能够阻止血液凝固的物质，称抗凝剂,6,.,乙二胺四乙酸（EDTA）盐,抗凝原理：,螯合钙离子,使用方法：,15g/L浓度EDTA 和血液 1：10,适用范围：,血细胞形态、血小板计数。但影响血小板聚集和白细胞吞噬功能所以不适合做凝血象检验及血小板功能试验,7,.,草酸盐（sodium oxalate）,草酸钠、草酸钾、草酸铵,原理：,草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固,用范围：,凝血象检查,8,.,肝素（heparin）,原理：,低浓度时抑制因子a、和PF,3,之间的作用，加强抗凝血酶,（,AT-,）,灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成,还能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子的作用；高浓度时阻断凝血酶和纤维蛋白的反应,适用方法：,1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10,优点：,抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温,适用范围：,红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白测定、红细胞比积）和多种生化分析,9,.,枸橼酸盐（枸橼酸三钠）,原理：,螯合钙离子,使用方法：,配成109 mmol/L的浓度和血液1：9,106 mmol/L的浓度和血液1：4,适用范围：,止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）,10,.,3.血液标本检验后的处理,血源性污染是医源性污染的主要来源之一，检验后的血液标本处理不当，其危害极大。对于检验完毕的血液标本首先要进行高压灭菌，然后再进行无害化处理。带有血液的检验器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要进行毁形、消毒并进行无害化处理。,11,.,四：血液涂片制备,血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。,血涂片的用途：,血细胞形态学检验、网织红、寄生虫检验,。,12,.,1：玻片的清洁,将载玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟，再用热水将肥皂、血膜洗去，自来水反复冲洗，必要时用95%的乙醇浸泡1小时，擦干备用。,新玻片常有游离碱质，用重铬酸钾洗液或稀盐酸（浓盐酸稀释10倍）浸泡24小时，再彻底洗涤。,使用玻片时，要手持玻片边缘，以保持玻片干燥、清洁、中性、无油腻。,13,.,2、血液涂片制备,将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。,14,.,图1-3 血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观）,15,.,血涂片质量评价,均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧,注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚,一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留有空隙，血膜长度约4厘米。,16,.,17,.,18,.,五、血液,细胞染色,染料：生物学染色剂，将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。,发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。,19,.,碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核,的染料。如亚甲蓝、天青。,酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧,烷,-,氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合,细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、,嗜酸性颗粒成分等。,复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料,20,.,细胞染色原理：,一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据。,物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等,化学作用：1.染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。,2.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同,数量的氨基（-NH,2,）和羧基（-COOH），同时还有其,它活性基团。在游离状态时NH,2,获得一个H,+,变成 带正电的-NH,3,+,，而-COOH失去一个H,+,变成带负电的-COO,-,。分别与不同染料结合。,3.周围环境的酸碱度：如环境pHpI（pI 为等电,点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之，pHpI，则结合碱性染料,。,21,.,（一）,瑞氏染色法,瑞氏染料,由酸性染料伊红,（eosin,E,-,）,和碱性染料亚甲蓝,(methylene blue,M,+,),组成复合染料,。亚甲蓝为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化天青。伊红通常为钠盐。将伊红和美蓝,溶解在甲醇中，即瑞氏染料。,M,+,CL+NaE-ME+NaCL,美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞氏染料）,22,.,染色原理,细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为,嗜酸性物质,；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为,嗜碱性物质,；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为,中性物质,。,23,.,图1-4 瑞氏染色原理示意图,24,.,PH对细胞染色有影响,细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，,在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。,因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。,25,.,试剂,Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml,甲醇的作用：1、溶解瑞氏染料。2、有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，固定血膜。3、使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的物理吸附作用，增强染色效果。,磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g,蒸馏水加到1000ml。,配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。,26,.,瑞氏染色方法,1.用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。,2.,加瑞氏染液覆盖血膜，固定,1min,。,3.,滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色,5-10,分钟。,4.,用清水冲洗，待干后镜检。,27,.,【质量控制】,血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落,.,染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。,染液不能过少，以防蒸发沉淀。,冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料,沉着。冲洗时间也不能长。,染色过淡，可复染。,染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色,.,28,.,29,.,【染色结果评价】,正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。,染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色，染色过酸pH3.5时，则呈现一片红色，白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。,染色环境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。,30,.,（二）姬姆萨染色法,原理,吉姆萨染液由,天青伊红,组成。染色原理和结 果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。,31,.,吉姆萨染料 1.0g,甘油 66.0ml,甲醇（AR）66.0ml,染色方法,1.甲醇固定干燥血膜3-5min,2.将血膜在染液中浸染10-30min,3.流水冲洗,待干后镜检,试剂,32,.,（三）瑞氏-吉姆萨染色,【原理】,将瑞特染料和吉姆萨染料按一定比例混合后对细胞进行染色，其染色原理同瑞特和吉姆萨染色法，但染色效果更佳，因为其综合了瑞士和吉姆萨染色法的优点。,33,.,【,瑞氏-吉姆萨染色,试剂】,瑞特染料 1.0g,吉姆萨染料 0.3g,甲醇 加至500ml,先将瑞特染料和吉姆萨染料充分研磨混匀，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的继续加入甲醇研磨，重复多次，最后把染液加至500ml。,34,.,瑞氏-吉姆萨染色方法,血片滴加染液5滴盖满血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸盐缓冲液（同瑞氏染液）缓冲液10滴，10min后用流水冲洗干净，待干后镜检。,35,.,【方法学评价】,瑞氏染液和吉姆萨染液对细胞进行染色时有各自的显色特征，前者对细胞质和颗粒着色较好，后者对细胞核结构显示清晰。因此将二者结合，能取长补短、集中优势，用该混合染液对血细胞进行染色，其细胞核、细胞质和细胞内颗粒均着色鲜艳，对比鲜明。瑞氏-吉姆萨混合染色法是临床上广泛使用的方法。,36,.,六、,血细胞显微镜计数法,Xingyue,37,.,六、血细胞显微镜计数法,（一）原理,用一定的稀释液将标本作定量稀释，混匀充入计数池中，在显微镜下计数一定容积中的血细胞数，经换算求得每升血液中的血细胞总数。,38,.,血细胞计数,人工显微镜计数法,自动血细胞计数仪法,Xingyue,直接计数法,间接计数法,半自动,（二、三分群）,全自动,（五分群）,39,.,显微镜细胞计数法,【,测定方法及评价,】,将样本做适当稀释（或浓缩），充入细胞计数池，在显微镜下计数计数板中一定体积内细胞数，经换算得每升标本的细胞数。,如：血液RBC、WBC、PLT、嗜酸细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞和单核细胞直接计数，体液细胞计数（,尿中细胞管型、精液中精子计数、脑脊液及浆膜腔积液细胞计数）,等。,该法计数误差较大，费时、费力，已不能适应大批量标本的测定，将逐渐被血细胞分析仪所取代。,Xingyue,40,.,【,试剂,】,各种不同的专用稀释液或染色稀释液。,【,器材,】,（1）,显微镜,（2）,微量吸管,：Hb吸管：10、20,l两刻度,毛细玻璃吸管：10、20,l两刻度,一人一管，定期用水银称重法进行校正,误差应 1%,（3）,计数板,：血细胞计数板，常用改良Neubauer计数板,计数板的构造：,（4）,血盖片,规格24mm,20mm0.6mm，,要求：表面平整（,不平整性0.002mm,），高倍镜检查无裂痕，且本身有一定的重量。,Xingyue,41,.,血细胞计数板的构造,24200.6mm,42,.,1855 年 发明计数红细胞的计数板,血细胞计数板法是最可靠和最经典计数技术,改良Neubauer,计数板,43,.,计数池划线,1 mm,1mm,44,.,计数池,45,.,计数池划线,美国国家标准局（NBS）1941年规定：计数池大方格每边长度的误差应在 1%内（10.01mm）;血盖片与计数池间缝隙深度应在2%以内(0.10.002mm)。,46,.,【操作】,（以血WBC计数为例）,WBC稀释液,0.38ml,+血,20l,混匀后30s后灌板,静置23min后,以低倍镜计数四角4个大方格内WBC数,（,计数原则,）,计算,WBC数/L,=,四个大方格细胞数,/4102010,6,/L,=,四个大方格细胞数,0.0510,9,/L,Xingyue,47,.,质量控制,(一)、技术误差,1、采血部位不当,2、血液凝固,3、稀释倍数不准,4、充液不当,5、识别错误,6、器材不符合要求,48,.,(二)、固有误差（inherent errors),泊森分布：,SD=m,CV=,注：SD为标准差、m为计数的平均数、CV为变异系数。,由此，计数范围大，计数细胞多，计数误差就小。,1/2,1,m,1/2,49,.,50,.,