土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(公开课).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,2:,微生物的培养与应用,课题,2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课题背景,1,、尿素的利用,尿素,是一种重要的,农业氮肥。,尿素,不能直接,被农作物,吸收。,土壤中的细菌将尿素,分解成氨,之后才能被植物利用。,2,、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们,能合成脲酶,CO(NH,2,),2,脲酶,+H,2,O,+CO,2,2NH,3,3,、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4,、课题目的,从土壤中分离出,能够分解尿素的细菌,统计,每克土壤,样品中究竟含有,多少这样的细菌,研究思路,.,筛选菌株,.,统计菌落数目,.,设置对照,1,、实例：,PCR,技术,启示：寻找,目的菌种,时要根据它对生存环境的要求，到,相应的环境,中去寻找。,原因：,因为热泉温度,70,80,0,C,，淘汰了绝大多数微生物只有,Taq,细菌被筛选出来。,DNA,多聚酶,链式反应,是一种在,体外将少量,DNA,大量复制,(PCR),的技术，此项技术要求使用,耐高温（,93,0,C,）的,DNA,聚合酶。,.,筛选菌株,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，,包括营养、生理、生长条件等；,方法：,抑制大多数微生物的生长,促进,目的菌株,的生长,结果：,培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2,、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于,目的菌株,生长的条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时抑制或阻止其他微生物生长。,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,3,、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：,葡萄糖,氮源：,尿素,培养基的,氮源为尿素,，只有能合成,脲酶,的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。,缺乏,脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4,、培养基选择分解尿素的微生物的原理,允许,特定种类,的微生物生长，同时,抑制或阻止其他种类,微生物生长的培养基，叫做,选择培养基,5,、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为,唯一氮源,的培养基,牛肉膏,蛋白胨,培养基,是,分离,尿素,细菌,判断该,培养基,有无选,择性,实验组,对照组,培养基类型,是否,接种,目的,结果,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1,、显微镜直接计数：,利用,血球计数板(,血细胞计数板,）在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.,统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点：,2.,间接计数法（,活菌计数法）,原理：,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的,一个菌落,是由,一个单细胞,繁殖而成的，即,一个菌落代表原先的一个单细胞。,常用方法：,稀释涂布平板法,。,每克样品中的菌落数,(C,V),M,其中，,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,？,说明设置重复组的重要性。,在设计实验时，一定要涂布至少,3,个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性,。在分析实验结果时，,一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验,。,注意事项,为了保证结果准确，一般选择菌落数在,30,300,的平板上进行计数。,为使结果接近真实值可将,同一稀释度加到三个或三个以上的平板中,，经涂布，培养计算出菌落平均数。,统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，,A,同学从对应的,10,6,倍稀释的培养基中筛选出大约,150,个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约,50,个菌落。分析其原因。,土样不同,培养基污染或操作失误,(,或者是混入了其他的含氮物质,),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,假设一：,由其他同学,用与,A,同学相同土样,进行实验,假设二：,将,A,同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：,如果结果与,A,同学一致，则证明,A,无误；如果结果不同，则证明,A,同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,如何验证,?,（三）设置对照,判断培养基中是否有杂菌污染：,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土,3 cm,左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“,微生物的天然培养基,”,一,土壤取样,数量最大、种类最多,大约,70%,90%,是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,二,制备培养基,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：,稀释倍数为,10,3,10,7,。,可准备,牛肉膏蛋白胨培养基,和,选择培养基。,每个稀释度下需要,3,个选择培养基，,1,个牛肉膏蛋白胨培养基。,将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显,多于,选择培养基上的数目，因此，,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了,选择,作用。,应在火焰旁称取土壤,10g,。,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,目的：保证获得菌落数在,30,300,之间、适于计数的平板,（三）样品的稀释,问题：,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：,土壤中各类微生物的数量（单位：株,/kg,）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为,2 185,万，放线菌数约为,477,万，霉菌数约为,23.1,万。,结论：,为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.,取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了,至少,2,个,菌落数目在,30,300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果,同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确,，需要重新实验。,.,微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔,24h,统计一次菌落数目。,选取菌落数目稳定时的记录作为结果，,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。,细菌：,30,37,培养,1,2d,放线菌：,25,28,培养,5,7d,霉菌：,25,28,的温度下培养,3,4d,。,微生物的培养与观察,菌落的形状、大小、隆起程度和颜色,操作提示,一,无菌操作,1,、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。,2,、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。,3,、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,二,做好标记,注明培养基种类、培养日期、平板培养样品,的稀释度等。,三,规划时间,三、,四、课题成果与评价,培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。,牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目,，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,1.,在以,尿素,为唯一氮源的培养基中加入,酚红,指示剂。培养某种细菌后，如果,PH,升高，指示剂将,变红,，说明该细菌能够分解尿素。,五,.,课外延伸,CO,（,NH,2,）,2,+H,2,O CO,2,+2NH,3,脲酶,pH,升高,指示剂（酚红）将变红,2.,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到,伊红,-,美蓝,培养基上培养，大肠杆菌,菌落呈现黑色,，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,五,.,课外延伸,本课题知识小结,:,