乙肝血清标志物检测ppt课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,乙肝血清学标志物检测及意义,山西医科大学第二医院检验科,郭先锋,要点,简介,抗原组成,传染源,传播途径,病原学诊断,血清学模式及临床意义,End,前 言,病毒性肝炎在我国各类传染病中发病率最高,乙型病毒性肝炎在我国危害极大,我国乙型肝炎患者近,3,千万,病毒性肝炎，一般特指由嗜肝病毒感染所引起的肝炎。,HBV-,属嗜肝,DNA,病毒,A,病毒性肝炎,Hepatitis Virus,肠道传播,肠道外传播,F,TTV,?,其它,E,NANB,B,D,C,病毒性肝炎,-,背景,传染源,粪便,血液,/,血源性物质/体液,血液,/,血,源,性物质/,体液,血液,/,血,源,性物质/,体液,粪便,传播途径,粪,-,口,经皮肤/,经粘膜,经皮肤/,经粘膜,经皮肤/,经粘膜,粪,-,口,慢性感染,否,是,是,是,否,病毒性肝炎类型,A,B,C,D,E,基因组类型,ssRNA,dsDNA,ssRNA,ssRNA,ssRNA,Hepatitis B Virus,乙型肝炎的病原体,乙型病毒性肝炎,1,是由乙肝病毒（,HBV,）引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。本病广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为,肝硬化,或,肝癌,。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病。,乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发 病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高趋势估计全球半数以上人口已被,HBV,感染过，5%的人口为,HBV,慢性感染,.,中国：乙肝高发区，人群,HBsAg,的检出率达9.8%,电镜下,Hepatitis B Virus,乙型肝炎病毒,HBV,乙型肝炎病毒（,HBV,）为专一的嗜肝,病毒,，近年由于,核酸,分子杂交技术的进展，在肝外器官,细胞,也能检出,HBV-DNA,。通过北京乙肝肝病毒试验研究提供了在肝外细胞复制的证据。人,HBV,也可能在肝外细胞内复制，有待深入研究。,HBV,感染者血清经电镜检查有,3,种病毒颗粒,.,1.,大球形颗粒，完整的,HBV,颗粒直径为,42nm,，又名,Dane,颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有,e,抗原。,乙型肝炎病毒,HBV,.,小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及成分，为不完整的,.,管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起的，也含有表面抗原,1.HBV,形态结构,大球形颗粒（,Dane,颗粒）,小球形颗粒,管形颗粒,HBV virion,The infectious virion is called the DANE particle.,Dane,颗粒（完整的病毒）形态,HBsAg,HBcAg,HBV DNA,DNAP,（外膜蛋白）,（核衣壳蛋白,）,Both comprised of HBsAg,HBV nomenclature,HBV:,h,epatitis,B,v,irus,HBsAg:,h,epatitis,B,virus,s,urface,a,nti,g,en,HBsAb:,h,epatitis,B,virus,s,urface,a,nti,b,ody,HBcAg:,h,epatitis,B,virus,c,ore,a,nti,g,en,HBcAb:,h,epatitis,B,virus,c,ore,a,nti,b,ody,HBeAg:,h,epatitis,B,virus,e,a,nti,g,en,HBeAb:,h,epatitis,B,virus,e,a,nti,b,ody,抗原组成,(一)-,HBsAg,位于病毒表面，是一种糖蛋白,(,曾用名：澳抗,),出现时间：,HBV,感染后,2,6,个月（潜伏期）,HBsAg,有,10,个亚型，各亚型间存在不完全的交叉免疫。近年用亚型单克隆抗体研究表明，,d,和,y,、,w,和,r,决定簇可以同时存在于同一病毒抗原颗粒上，形成,adwr,、,aywr,、,adyw,和,adyr,复合亚型。,其机制为不同亚型病毒的双重感染；单一亚型病毒感染后，有的,HBV-DNA,发生点突变。临床表现病情反复，肝脏损害较重，因而有的,HBV,感染者血清中同时,HBsAg,阳性、抗,-HBs,阳性。,4种亚型(,adr,adw,ayr,ayw,)。刺激机体产生保护性抗体即抗-,HBs.,HBsAg,血清中,HBsAg,阳性是,HBV,感染的标志。本身具有抗原性，无传染性。但由于,HBsAg,常与,HBV,同时存在，故认为是传染性标志之一。但须注意，,HBV-DNA,可自,X,基因区终点起逆向与肝细胞发生整合，整合后的,S,基因表达较强，不断产生,HBsAg,，整合的,HBcAg,基因组被抑制，不表达,HBeAg,、,HBcAg,，在这种情况下，即使,HBV,已从体内清除，而,HBsAg,仍可持续阳性，从理论上讲，这种,HBsAg,阳性血液并无传染性。,急性,HBV,感染后，血清中首先出现,HBsAg,，整个急性期均可阳性，至恢复期可滴度下降或转阴。如,HBsAg,持续阳性半年以上，称为慢性,HBsAg,携带者（无症状,HBsAg,携带者），可持续阳性达数年。一般认为,HBsAg,滴度与病变程度不成比例。肝功能正常，,HBsAg,滴度高，肝脏可重要病变，若,HBsAg,阴性及,DNAp,阴性，表示无重要传染性。反之，肝功能异常，,HBsAg,滴度不高，肝脏可有明显病变，如有部分肝硬化、肝癌患者呈,HBsAg,阴性或低滴度。无症状,HBsAg,携带者或慢性活动性乙型肝炎均可有相同的,HBsAg,滴度变化不能代表病情的轻重，因此分解此不能将,HBsAg,滴度的变化作为判断病情轻重和药物治疗效的指标。,用免疫电镜及免疫荧光法在肝细胞浆内证实有,HBsAg,而血清中,HBsAg,阴性，其机制尚无确切解释。已知原因之一是现用的,RIA,检测法，其测试灵敏度为,10-5,尚不能测出最低感染量,(10-7),，因此有,10%,假阴性，故对,HBsAg,的判断，以阳性有诊断意义，阴性不能排除,HBV,感染。近年发现血清中,HBV,标志均阴性，而在白细胞或肝细胞内检出,HBV-DNA,，说明确定或除外,HBV,感染不能单凭,HBsAg,是否阳性，应与其他标志结合判断。,HBsAg,持续时间,急性自限性肝炎：血中,HbsAg,大多可持续,1-6,周，最长可达,6,个月内可消失,慢性肝炎或慢性,HBsAg,携带者：可持续阳性。,抗原组成,(二,)-,HBcAg,HBcAg,为,HBC,复制指标,.,位于,Dane,颗粒核心部分和肝细胞核内，在血清中不易检出游离的,HBcAg,主要成分是蛋白质,刺激机体产生抗-,HBc,(,非保护性抗体,),存在于受感染的肝细胞核内，有很强的免疫原性，在乙肝急性期、恢复期和,HBsAg,携带者中常可检出抗,-,HBc,。除非,HBV C,基因序列出现极少数变异或感染者有免疫缺陷。,抗-,HBc IgM,阳性提示急性期或慢性感染急性发作，抗,HBc IgG,出现较迟，但可保持多年或者终生。,（,抗,-HBs,出现时间：急性感染后期或,HBsAg,转阴后（数月才能检测出）,.6-12,月内逐步上升至高峰，可持续多年，但滴度会逐渐下降。,抗,-HBs,为保护性抗体（中和抗体）其出现标志着,HBV,感染进入恢复期,-HBs,对相同,HBsAg,亚型的,HBV,再感染有免疫力，但对不同亚型的,HBV,保护力不完全。,抗原组成,(三,)-,HBeAg,位于,HBV,的核心,是一种可溶性蛋白抗原,HBeAg,和,Dane,颗粒出现相平行，且与,DNA,多聚酶在血中的消长动态相符合,血中,HBeAg,的出现可作为,HBV,复制及血清有感染性的指标,.,急性,HBV,感染时,HBeAg,的出现时间略晚于,HBsAg,，在病变极期后消失，如果,HbeAg,持续存在预示趋向慢性。大部分情况持续存在表示患者处于高感染低应答期。,刺激机体产生抗-,HBe,。转换过程意味着由免疫耐受转换为免疫激活，此时常有病变活动的激化。,抗-,HBe,能与受染肝细胞表面的,e,抗原结合,通过补体介导破坏受染的肝细胞,抗-,HBe,的出现是预后良好的征象。抗,HBe,阳转后，病毒复制处于静止状态，传染性降低。部分病人仍有病毒复制，肝炎活动，称为,HBeAg,阴性慢性肝炎。,HBV DNA,是病毒复制和有传染性最直接的证据,检测方法：斑点杂交法、,PCR,法近年用多聚酶链反应（,PCR,）这一体外,DNA,扩增技术，使灵敏度提高,100,倍以上（,10FGfg/ml,），可测出极微量的病毒。,HBV-DNA-p,是,HBV,核心所具有的,DNA-p,，在病毒复制过程中起逆转酶作用。,DNA-p,活性是表示,HBV,复缺点活力的重要指标。,HBV-DNA,及,DNA-p,检测有助于判断,HBV,感染者病毒复制程度及,传染,性大小，较灵敏评价抗病毒药物的疗效。,乙 肝,抗原组成,(四,)-Pre-S,抗原,位于,HBV,的外衣壳上，有两种,刺激机体产生抗,Pre-S,1,和抗,Pre-S,2,，,能阻断,HBV,与肝细胞受体结合，从而起到抵抗病毒,的作用,抗,Pre-S,1,和抗,Pre-S,2,的出现，表示病情好转，趋向痊愈,传染源,患者,潜伏期,急性期,慢性期,无症状,HBsAg,携带者,高,中等,低/不能检出,血液,精液,尿,血清,阴道分泌物,粪便,伤口渗出物,唾液,汗液,泪液,乳汁,各种体液中,HBV,的浓度,血源性传播,输血、注射、外科和牙科手术、针刺等,剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等,母婴垂直传播,宫内传播,分娩时微小皮损处传播,产后母婴密切接触,性传播,HBV,传播途径,病原学诊断,(一),-抗原抗体检测,项目：,HBsAg、,抗-,HBs、HBeAg、,抗-,HBe、,抗-,HBc,以及抗-,HBc IgM,方法,ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，,最常用，定性),发光免疫分析(定量,),反相间接血凝试验(少用,),ELISA,的基本原理,利用抗原和抗体特异性结合,主要的试剂,固相抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶的底物,ELISA,的主要方法,间接法:测定抗-,HBs,夹心法：测定,HBsAg,和,HBeAg,竞争法：测定抗-,HBc,中和法：测定抗-,HBe,捕捉法：测定抗-,HBc IgM,病原学诊断,(二),核酸检测,核酸杂交,探针,PCR,引物,各项,HBV,血清标志物的解释,HBsAg,HBV,感染的标志,可能是急性或慢性,Anti-HBs,既往感染自然免疫/接种疫苗产生,Anti-HBc IgM,急性,HBV,感染标志,Anti-HBc IgG,既往或慢性,HBV,感染,HBeAg,病毒复制活跃，具有高度传染性,Anti-HBe,慢性感染,病毒不再复制,低传染性,HBV-DNA,直接测定病毒复制状态，比,HBeAg,更准确；临床主要用于监测治疗反应,为什么要开展乙肝,“,两对半,”,定量检测,乙型病毒性肝炎是世界性的传染病，严重地威胁着人类的健康。我国是乙型病毒性肝炎高发病国家。据统计全世界无症状携带者（,HBsAg,携带者）超过,2.8,亿，我国占,1,亿以上，且多数无症状。所以乙肝的早期诊断对控制传染源、降低发病率及疾病的治疗均具有很重要的意义。酶标（,ELISA,）检测始于,20,世纪,80,年代中期，它对乙肝“两对半”定性测定在疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用，但酶标检测,HbsAg,灵敏度较低，不能真正意义上定量测定血清中,HbsAg,含量。随着临床医学的发展，定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求。化学发光免疫分析定量测定乙肝“两对半”大大弥补了酶标定性测定及灵敏度低的不足。,血清学检测的临床意义,HBsAg,抗-,HBs HBeAg,抗-,HBe,抗-,HBc,临床意义,急性或慢性感染(大三阳),+,-,+,-,+,+,+,+,乙肝后期或慢性感染(小三阳),-,-,+,+,-,-,-,潜伏期或急性乙肝早期痊愈或恢复期,有免疫力,-,-,-,-,-,+,+,+,-,-,痊愈,有免疫力,疫苗接种或曾经感染过,有免疫力,血清学检测的临床意义,HBsAg,抗-,HBs HBeAg,抗-,HBe,抗-,HBc,临床意义,血清学检测的临床意义,血清学检测的临床意义,急性或慢性感染(传染性弱,),+,-,-,-,+,-,+,+,急性,乙肝恢复期或既往感染,-,-,-,-,-,-,+,急性窗口期或既往感染康复期,-,-,-,-,-,未感染过,HBV,+,+,-,-,+,+,+,-,-,+,急性感染趋向恢复,;,慢性携带者,HBV,感染已恢复,有免疫力,Symptoms,HBeAg,anti-HBe,Total anti-HBc,IgM anti-HBc,anti-HBs,HBsAg,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,100,Acute HBV Infection with Recovery,Typical Serologic Course,Weeks after Exposure,Titre,IgM anti-HBc,Total anti-HBc,HBsAg,Acute,(6 months),HBeAg,Chronic,(Years),anti-HBe,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,Years,Weeks after Exposure,Titre,Progression to Chronic HBV Infection,Typical Serologic Course,小结,乙肝五项检测的影响因素,1.,样本采集与处理的影响,1.1,标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。,1.2,塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加,OD,值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；,EDTA,、酶抑制剂（如,NaN3,）可抑制,ELISA,系统中辣根过氧化物酶活性。,1.3,标本凝固不全，正常血液采集后,1/22h,开始凝固，,1824h,血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在,ELISA,测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。,乙肝五项检测的影响因素,2,、试剂的影响,2.1,乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为,89.4%99.3%,7889%,存在较大差异。有的厂家酶标板孔间,A,值差大于,15%,；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。,2.2,不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用,ELISA,检测,HBsAg,结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。,乙肝五项检测的影响因素,3,、干扰物质的影响有人认为大约,40%,的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠,Ig,抗体、交叉反应物质和其它物质等。如,RF,因子可与标记二抗的,FC,段法结合造成假阳性，补体从,C1q,活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，,Fc,的,C1q,分子结合点暴露出来，则补体,C1q,可将二者连接起来造成假阳性，采用,5630,分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的,AFP,（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。,乙肝五项检测的影响因素,4,、药物的影响,4.1,高效价的乙肝免疫球蛋白会与,HBsAg,形成复合物，影响,HBsAg,的检出，所以一些,HBsAg,阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，,HBsAg,检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第,8,、,9,、,10,月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇,HBsAg,的检出；而且其所生产的生新儿也常出现,HBsAg,阴性，,HBeAg,阳性和,HBcAb,阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属,IgG,抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的,HBsAg,结合形成复合物；则新生儿,HBsAg,检测呈阴性；用,0.5ML,的盐酸处理标本,1,小时可提高出率。,4.2,为预防乙肝，部分,HBsAg,阴性人群在接种乙肝疫苗后的,1,2,周内，血清中可检出,HBsAg,成份，形成一过性,HBsAg,阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是,HBsAg.,，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后,1,个月内不应作,HBsAg,检测。,乙肝,DNA,检测的临床意义,HBV-DNA,称为乙肝病毒脱氧核糖核酸。乙肝病毒是一种部分双链,DNA,病毒，也就是说它的遗传物质是,DNA,，它载有病毒所有遗传信息，乙肝病毒靠它才可以复制、增殖、繁衍后代。研究证明，乙肝病毒的裸,DNA(,没有蛋白质包裹,DNA),就有感染性，完成对宿主的侵袭，造成宿主体内出现完整的乙肝病毒颗粒。也就是说,HBV-DNA,相当于完整的乙肝病毒颗粒。因此，检测,HBV-DNA,是判断乙肝病毒有无复制的,“,金指标,”,。,DNA,的检测的目的主要是判断目前患者病毒复制程度的大小，也是传染性大小，尤其在判断乙肝的转归，以及用药前后的疗效的判断有很重要的作用，也是重要的用药指征之一，尤其是抗病毒治疗。现在这种基因的检测技术已经广泛的应用于临床。,应采取以疫苗接种和切断传播途径为重点的综合性措施。,一,.,乙肝疫苗和,乙肝免疫球蛋白,（,HBIG,）的应用在目前,HBsAg,携带者广泛存在，传染源管理十分困难的情况下，控制和预防乙型肝炎，关键性措施是用乙肝疫苗预防。我国已将乙肝疫苗接种纳入计划免疫，此外下列人群亦为乙肝疫苗接种的适应症：,HBsAg,阳性，特别是,HBeAg,同时阳性母亲所生的新生儿；乙肝高发区,3,岁以下幼儿；医务人员，接触血液的人员；多次接受输血及血制品的患者；,HBsAg,阳性者家庭成员，尤其是配偶，凡是患有急性或慢性疾病或对福尔马林和抑菌剂硫柳汞过敏者禁用。,预 防,HBsAg,阳性孕妇的新生儿用,30,g,免疫,3,针；,HBsAg,阴性孕妇的新生儿第,1,针为,30,g,，第,2,、,3,针各为,10,g,；,高危人群，如肾透析患者和其他职业性与乙肝密切接触者,用,20,g,免疫,3,针；,其他一般易感人群（包括儿童、成人）,10,g,免疫,3,针。以,上均按,0,、,1,、,6,月免疫程序，但新生儿第,1,针应在出生后,24,小时内接种，免疫效果更好。也有用,0,、,1,、,2,月免疫程序者,。目前多主张对高危人群（尤其,HBsAg,阳性，同时,HBcAg,阳性孕妇的新生儿；,接种乙肝疫苗因人而异我国应用的免疫剂量和程序,意外受,HBV,感染，如被,HBsAg,阳性血液污染的针头刺伤 或被,HBsAg,阳性血液溅入眼结膜或口腔粘膜或输入,HBsAg,阳性血液、手术刀损伤皮肤等），一般应立即（,24,小时之内）肌肉注射乙肝免疫球蛋白。如,HBIG,每毫升含抗,-HBs200IU,以上者可注射,0.5,0.7ml/kg,。,THE END,欢迎指正,