还原糖含量的测定.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,我 要 我 的 音 乐,实验六还原糖和总糖含量的测定,（,3,5-,二硝基水杨酸比色法）,目的,通过本次实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。,原理,还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖。乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，其基本原理是,用比色法对还原性的单糖进行测定,，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。,在碱性条件下，还原糖与,3,5-,二硝基水杨酸试剂（,DNS,）共热，,3,5-,二硝基水杨酸被还原为,3-,氨基,-5-,硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在,540nm,波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线并计算，就可以分别求出样品中还原糖和总糖的含量。,管号,0,1,2,3,4,5,6,葡萄糖液（,ml,）,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,蒸馏水（,ml,）,2.0,1.8,1.6,1.4,1.2,1.0,0.8,DNS,试剂,(ml),1.5,1.5,1.5,1.5,15,1.5,1.5,加热,同时一起在沸水浴中加热,5min*,冷却,立即用流动冷水冷却至室温,蒸馏水,(ml),21.5,21.5,21.5,21.5,21.5,21.5,21.5,吸光值,(A,540,),操作步骤,1,、绘制葡萄糖标准曲线,将以上各管,上下颠倒几次使溶液混匀,后，按顺序倒入比色杯中，在,540nm,波长条件下进行比色测定：用,0,号管溶液调零点，分别记录各管吸光值；然后以葡萄糖浓度为横坐标，,吸光值,为纵坐标，绘制出标准曲线。,2,、测定样品中还原糖和总糖含量。,（,1,）提取样品中的还原糖：,准确称取,1g,食用面粉放置于,100ml,三角瓶中，加少量蒸馏水调成糊状，再加入,50ml,蒸馏水，摇匀，置于,50,水浴条件下,20,分钟，使还原糖浸出；在,4000rpm,、,5,分钟条件下进行离心，得到的上清液倒入,100ml,容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，,上下颠倒几次,将溶液混匀，作为还原糖待测液。,（,2,）提取样品中的总糖：,准确称取,0.1g,食用面粉放置于,100ml,三角瓶中，加入,10ml 6mol/L HCl,及,15ml,蒸馏水，沸水浴,30,分钟（,注意不能把水烧干,）。用滴管吸取,12,滴水解液于白瓷板上，加,1,滴,I-KI,溶液，如显示出蓝色说明水解不完全，可适当延长沸水浴时间；若不显蓝色，则说明水解完全。,待水解液冷却至室温后加入,1,滴,酚酞指示剂，用,6mol/L NaOH,中和至微红色，在,4000rpm,、,5,分钟条件下离心，得到的上清液转移到,100ml,容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，,上下颠倒几次,混匀溶液，作为总糖待测液。,（,3,）显色和比色，按下表操作,管号,还原糖,总糖,样品量（,ml,）,2.0,1.0,蒸馏水（,ml,）,0,1.0,DNS,试剂,(ml),1.5,1.5,加热,同时一起在沸水浴中加热,5min*,冷却,立即用流动冷水冷却至室温,蒸馏水,(ml),21.5,21.5,吸光值,(A,540,),结果处理,以,1,、,2,号管的吸光值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖,毫克数,。按下列公式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：,注意事项,1,、标准曲线制作与样品含糖量测定应,尽量同时进行,，,一起显色和比色,。,2,、实验过程中所有的试管要,洁净,，加入各种试剂量要准确。,3,、试剂,不可倒出试剂瓶,，,必须,用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，放回原处。,4,、移液管使用：有色,看外边缘,，无色,看中间凹处,。,5,、沸水浴：,须等水沸腾后,，才能将要加热的物品放入锅中；时刻注意锅内的水，,防止烧干,。,6,、每组同学离开实验室时，必须经实验老师检查并同意后，方可离开。,7,、值日生打扫干净实验室后，方可离开。,