生化药物制造工艺核酸类药物.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021,*,1,2021,随着,分子生物学和遗传工程,的发展，,基因治疗,应运而生，得到广泛的肯定。,其中包括反义核酸技术，简称反义技术,。,利用这一技术研制的药物称为,反义药物,，根据,核酸杂交原理,，,反义药物能与特定基因杂交,，在,基因水平干扰致病蛋白,的产生过程，及,干扰遗传信息,从核酸向蛋白质的传递。,反义核酸作为药物与常规药物相比有,两个显著特点：,有关疾病的,靶基因,mRNA,序列,是已知的，因此，设计合理,特异性的反义核酸,比较容易；,反义,寡核苷酸,与,靶基因,能通过,碱基配对原理,发生,特异和有效的结合,从而,调节基因的表达,。,2,2021,它的缺点,是天然的寡核苷酸,难以进入细胞内,、而一旦进入又易被,胞内核酸酶水解,，很难,直接用于治疗,。,核酸疫苗,是将编码某种,抗原蛋白,的,外源基因,（,DNA,或,RNA,）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的,转录系统,合成,抗原蛋白质,，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的,免疫应答,以达到,防病治病的目的,。,核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫,。,DNA,疫苗为目前尚,无满意疗法,的某些疾病（如慢性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病）提供一种,新的治疗途径。,3,2021,二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产,（一）RNA与DNA的提取与制备,1RNA的提取与制备,（l）,工业用RNA的提取,RNA及其工业来源,从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的,核酸资源,，如,酵母,、,白地霉,、多种抗菌素的,菌丝体,。,通常在细菌中RNA占525，在酵母中占2.715，在霉菌中占0.7%28,。,4,2021,在菌体内,RNA含量,的变化受,培养基组成,影响，其中关键是,铵离子浓度和磷酸盐浓度,。培养,酵母菌体,收率高，易于提取RNA。,很显然在许多酵母中，,早期细胞中的RNA含量高,，其确切数值取决于,碳、氮比例,和培养基组成等。,高RNA含量酵母菌株的筛选,可以从自然界,筛选,到,RNA含量高的酵母菌株,，也可用,诱变育种,的方法提高酵母菌的RNA含量。,工业废水培养高含量RNA酵母,RNA的提取的方法：,5,2021,稀碱法：,是用,氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性,，使,核酸从细胞内释放出来,。需用酸中和,pH7,。然后,除去菌体,，将pH调至RNA的,等电点（pH2.5）,，使,RNA沉淀,出来。,此法的缺点,是制得的RNA,M,r,较低,(,磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，,90 保持34h破坏酶,)。,浓盐法：,是用,高浓度盐溶液（6%8%）,处理，同时,加热,，以,改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来,。,要避免,分子降解,，可采用,苯酚法,制备,RNA,。用,苯酚处理,生物材料，使,蛋白质变性,，然后离心，上层水溶液内含有,全部RNA,，可用,乙醇沉淀,出来。,6,2021,脱氧核糖核蛋白,溶于,浓盐溶液1mol/L,不溶于,0.14mol/,L,而,核糖核蛋白,溶于,0.14mol/L,盐溶液,。,RNA的提取实例：,啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含,NaOH,3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molL HCl,调至pH7,，搅拌15分钟，,离心,得清液255m1。,冷至10以下,，6molL HCl调,pH2.5,，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80）。,7,2021,8,2021,2、DNA的提取与制备,（1）工业用DNA的提取,取新鲜冷冻,鱼精,20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至,100，保温15分钟,，,迅速冷却至2025,，离心除去,鱼精蛋白,等沉淀物，获得,35L含,热变性DNA,的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于,酶法降解,生产脱氧核苷酸。,如要制成,固体状DNA,，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积,95乙醇,，离心可获得纤维状DNA，,沉淀用乙醇、丙酮洗涤,，减压低温干燥得,DNA粗品,，产品,含热变性DNA 5060,。,9,2021,2、具有生物活性DNA的制备,动物内脏（肝、脾、胸腺）加,4倍重量生理盐水,经,组织捣碎机,捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟。将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，,加入2倍量5的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠,，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加入等体积的,冷95乙醇,，离心即可得到纤维状DNA，再用,冷乙醇和丙酮洗涤,，减压,低温干燥,得粗品DNA。,粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入,5十二烷基磺酸钠,达110体积，,搅拌1小时,，经5000rpm离心1小时，清液中,加入NaCl达1molL,，再缓慢加入,冷95%乙醇,，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有,生物活性的DNA,。,10,2021,（二用酶解法、发酵法和半合成法,制备核苷酸,1、酶解法及碱水解法制备核苷酸,（1）酶解法制备,脱氧核苷酸,桔青霉,产生,5-磷酸二脂酶,红酵母,产生,3-磷酸二脂酶,11,2021,12,2021,（2）,酶解法制备,戊糖核苷酸,我国从60年代开始使用,核酸酶P1,降解核糖核酸生产,单核苷酸,，日本年产,呈味核苷酸,（,肌苷酸和鸟苷酸,）3000吨，其中60%是,使用酶解法,生产的。,酶解法生产5单核苷酸工艺流程,13,2021,14,2021,（3）双酶法生产,肌苷酸和鸟苷酸,（IG）,呈味核苷酸,的主要品种是,肌苷酸钠和鸟苷酸钠,，商品名简称为,（IG）,，用,核酸酶Pl,降解RNA可获得,GMP和AMP,，其中,AMP经脱氨生成IMP,。双酶法生产（I十G）工艺。,15,2021,（4）菌体自溶法生产核苷酸,磷酸二酯酶,在合适的条件,下降解细胞内的RNA,可产生,5-核苷酸,。在国内用谷氨酸产生,菌体自溶法,生产,5-核苷酸,。,（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：,16,2021,（5）碱水解法生产2，3-混合核苷酸,RNA结构中的,磷酸二酯键,对于,碱性条件,不稳定，很容易生成,2，3-环状磷酸酯,，此环状磷酸酯,对碱更不稳定,，很易,加水分解,生成,2，3-混合核苷酸,。,从,RNA水解成2，3-核苷酸的降解率达95以上,，将,2，3-混合核苷酸,制成每片含,50100mg的片剂,。,经临床使用，对非特异性血小板减少症、对,白血球减少症,、癌肿的化疗和放疗后的,升白血球,均有较好疗效。,17,2021,18,2021,2、发酵法生产核苷酸,（1）发酵法生产,肌苷酸（IMP）,（2）发酵生产,黄苷酸（XMP）,及酶法转化成,鸟苷酸,19,2021,3、半合成法制备核苷酸,由于,发酵法生产核苷,的产率很高，,核苷悬浮于,磷酸三甲酯或磷酸三乙酯,中，在冷却条件下加入,氯化氧磷，进行磷酸化,，从,核苷,生成,5-核苷酸,收率可达,90%,。,例一：,肌苷,2mmolL悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmolL，,反应2h,，,5-IMP,摩尔,产率达91,。,例二：,鸟苷,2mmolL悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmo/L，,反应6h,，,5-GMP,摩尔,产率达90%,。,20,2021,（三）核苷的制备,本节叙述,核苷,的,化学法,和,发酵法,生产。,1、RNA化学水解法制备核苷,（1）核苷生产工艺流程,RNA经,甲酰胺化学水解,制备核苷,21,2021,22,2021,2、发酵法生产核苷,发酵法生产核苷,是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多,共同特点,：,它们都使用,磷酸单酯酶,活力很强的,枯草芽孢杆菌,或短小芽孢杆菌为诱变,出发菌株,；,它们都是通过使用,物理或化学诱变,方法选育出在,遗传性状,上具有,特定标记的诱变菌,；,它们在发酵培养时必须提供,限量的生长因素,，并且,好氧,，在某一特定的范围内累积大量核苷。,23,2021,（1）发酵法生产,肌苷,(枯草杆菌),（2）发酵法生产,鸟苷和黄苷,(肌苷产生菌),（3）发酵法生产,腺苷,(产氨短杆菌),三、重要核酸类药物的制备,24,2021,一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）,（一）结构与性质,AZT,是,1987美国FDA批准,的治疗,艾滋病,的新药,。,AZT的药理作用是人体内经,磷酸化,后生成了,3-叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸,，后者,取代,了正常的,胸腺嘧啶核苷酸,参与,病毒DNA的合成,，含有AZT成份的DNA,不能继续复制,，从而达到,阻止病毒增殖的目的,。,（二）生产工艺,此合成路线的,起始原料,是,胸苷,。,25,2021,26,2021,（二）阿糖腺苷Adenine arabinoside,1、结构与性质,阿糖腺苷,的化学名称为9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称,腺嘌呤阿拉伯糖苷,。,早在,1960年,就在实验室,合成了阿糖腺苷,，,1969年,美国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，,1972年,日本用Streptomyces hebacecus 4334菌株发酵法分别制备了阿糖腺苷,。,1979年,用 从EColi中分离得到的,尿嘧啶磷酸化酶,和,嘌呤核苷磷酸化酶,，以,固相酶,的方法,将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷,。,27,2021,2、生产工艺,（1）酶-化学合成法,最新的,阿糖腺苷,的合成法是,酶-化学合成法,：,用,尿苷,为原料生成,氧桥化合物,，水解成,阿糖尿苷,，,经,酶法,转化成,阿糖腺苷,。,经选育的优秀菌株是,产气肠杆菌,，能产生,尿苷磷酸化酶,（Upase）和,嘌呤核苷磷酸化酶,（Pynpase），从,阿糖尿苷,和,腺嘌呤,能高效地合成,阿糖腺苷,，菌体也可制成,固定化细胞,进行连续生产。,28,2021,29,2021,（2）以5-AMP为原料的化学合成,3、作用与用途,阿糖腺苷,是近年来引人注目的,广谱DNA病毒抑制剂,，,对单纯,疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用,。,而且,阿糖腺三磷,对于,病毒DNA聚合酶,的,亲和性,比,宿主细胞的同一个酶的,亲和性高,。因此这个药物对于抑制病毒具有,较高选择性,。,30,2021,（三）三氮唑核苷,1、结构与性质,三氮唑核苷,商品名,病毒唑,，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。,这个化合物,在体内,被磷酸化成三氮唑核苷酸,，抑制,病毒DNA合成,。,31,2021,2 生产工艺,酶合成法,使用,产气肠杆菌,，以（,尿苷,）,肌苷和TCA,（,三叠氮羧基酰胺,）,为底物可以用酶法简易地合成,三氮唑核苷,32,2021,采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用,嘧啶核苷磷酸化酶,，后段使用,嘌呤核苷磷酸化酶,。,四、阿糖胞苷,（一）结构与性质,阿糖胞苷,又称,胞嘧啶阿拉伯糖苷,，糖的组成部分是,阿拉伯糖,。,阿糖胞苷进入体内转变为,阿糖胞苷酸,，,抑制DNA聚合酶，抑制DNA的合成,，,干扰,DNA病毒,繁殖,和肿瘤细胞,增殖,。,33,2021,（二）生产工艺,1以5CMP为原料的合成法,（1）工艺路线：,34,2021,2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线,35,2021,（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）,1、结构与性质,1967年,美国人Field发现,聚肌胞,是,干扰素诱导物,，而且具有,广谱抗病毒作用,。本品是,人工合成的干扰素诱导剂,，系由,多聚肌苷酸和多聚胞苷酸,组成的双股多聚核苷酸。本品可,溶于0.85氯化钠,溶液。,2、生产工艺,聚肌胞生产工艺如下：,1）底物,5-核苷二磷酸吡啶盐,的制备,2）固定化,多核苷酸磷酸化酶,36,2021,（3）固定化多核苷酸磷酸化酶,，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到,共价结合的固定化多核苷酸磷酸化酶,。,3、Poly I：C制备,（1）底物预处理,：,CDP吡啶盐转成锂盐，IDP吡啶盐转成钠盐。,（2）酶促反应：,（每毫升反应液含molL数）,IDP或CDP,15；Tris 150；MgC1,2,6；,37,2021,EDTA 1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34小时。用,盐酸调pH1.52.0,，,使PolyI（或Poly C）沉淀,，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，,等摩尔Poly I与Poly C混合，生成产品,。,（三）作用与用途,本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用,。,本品注入人体,诱导产生干扰素。,38,2021,六、胞二磷胆碱（CDP-胆碱）,（一）结构与性质,胞二磷胆碱,其化学名称为,胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐,本品为白色无定形粉末，,易吸湿,，,易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂,。,39,2021,