生化药物制造工艺.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,重要生物药物制造工艺,E-mail,：,xinmigwy,Tel,：,3831677,发酵工程教研室 郭伟云,第 三 篇,1,本门课程由以下三大部分内容组,成,基础篇：生物制药工艺基础,1,技术篇：生物分离工程技术,2,品种篇：重要生物药物制造工艺,3,2,生物药物的类别,（一）天然生物药物,1.,微生物药物,microbial medicine,2.,天然生化药物,Biochemical medicine,3.,海洋生物药物,marine medicine,（二）生物技术药物（新生物制品）,1.DNA,重组药物（,DNA recombinant,medicine,）,基因工程与蛋白质工程药物,2.,基因药物,（三）合成或半合成生物药物,3,1.,迅速被体内酶降解,2.,肾小球过滤清除,3.,抗原抗体反应,4.,溶解度差导致沉淀,蛋白质药物在使用中出现的问题,T,C,实际浓度,理想浓度,体外聚乙二醇修饰（,PEG,化）,(1),增大药物分子量，避免被肾小球过滤,(2),阻碍蛋白酶的降解作用,(3),屏蔽药物的免疫位点,(4),增加药物在体液中的溶解度,(5),与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH,3,(-O-CH-CH),n,-OH,修饰粒细胞集落刺激因子（,rhG-CSF,）延长半衰期,修饰人肿瘤坏死因子消除副作用,修饰白介素,I,受体拮抗剂（,rhIL-1Ra,）延长半衰期,修饰牛胰核糖核酸酶（,RNase,）提高抗肿瘤活性,修饰超氧化物歧化酶（,SOD,）提高半衰期,修饰天冬酰氨酶（,Aspartase,）克服免疫原性,提高半衰期,修饰人干扰素（,IFN,）提高半衰期,修饰血红蛋白（,Hb,）血液代用品,修饰胰岛素提高半衰期,我国在,PEG,修饰蛋白质方面的一些工作,生化药物制造工艺,第 十 三 章,7,生化药物的定义、分类、特点,定义,：,具体运用生物化学研究方法，从,生物体,中经,提取、分离、纯化,等手段获得的天然存在的生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新的活性物质，通称生化药物（,Biochemical medicine,）。,8,重点,酶类药物,辅酶类药物,核苷酸与核酸类药物,多肽类药物,氨基酸类药物,蛋白质类药物,多糖类药物,脂类药物,分 类,9,维生素类药物,生化药物的特性,1,药理学特性：,1,药理活性高，针对性强,毒副作用少，营养价值高,2,生理副作用常有发生,免疫原反应，过敏反应,3,10,生化药物的特性,2,理化特性：,1,有效物质含量低，杂质多，工艺复杂，收率低，技术要求高,结构复杂，生物活性受空间结构严格限制，稳定性差,2,生物材料易染菌，腐败,3,11,生化药物的特性,3,天然生物药物是新型药物的先导物,通过合理的药物设计，可以创造出疗效更高，作用更专一，更易为机体接受，副作用与不良反应更小的新药。,12,70-80,年代,50-70,年代,有机溶剂分级分离、等电点沉淀等,-,粗提物。,离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术,-,提高了产品的纯度和收率,多种层析技术、超速离心等,-,高纯度的生化药物,生化药物发展概况,13,生化药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,14,主要从以下脏器中制取生化药物,15,毒蜥,Exendin-4,是自毒蜥唾液中提取的一种多肽，研究发现该多肽与人体内的,GLP-1,在序列上有,53,的同源性，同,GLP-1,一样具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保护胰岛,细胞等作用。,2005,年经,FDA,批准用于二型糖尿病的治疗。,Exenatide,是,Exendin-4,的人工合成品。,Exenatide,16,麻省,Transmolecular,公司的科学家将放射性,I,131,附着于自蝎子毒液中提取的一种多肽制成药物，研究发现该药物具有靶向性，对晚期神经胶质瘤有较好疗效，患者只需要从外部注射这种化合物，而无需再进行化疗或放射治疗。,蝎 毒 肽,17,生物药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,18,微 生 物,1,利用微生物作为工具,微生物的代谢物,2,微生物菌体,19,生物药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,20,海 洋 生 物,1,海藻类：,已知的海藻有,1,万多种,海洋动物类：,腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类,2,海洋微生物：,3,21,僧袍芋螺,齐考诺肽（,ziconotide,）最初由僧袍芋螺中提取，现已人工合成，是一种神经细胞钙通道阻断剂。作为一种非阿片类镇痛药物，用于治疗严重的慢性神经性疼痛，其鞘内注射剂经,FDA,批准于,2005,年上市,。,齐考诺肽（,ziconotide,22,DidemninB,是一种由,7,个氨基酸和,2,个羧酸组成的带有分枝的环缩肽，既能抑制蛋白质的合成,也能抑制,DNA,、,RNA,的合成，对黑色素瘤,B16,细胞周期作用的研究表明，它可杀伤各期细胞，尤以,G1,至,S,期细胞敏感，它可快速完全介导,HL-60,细胞凋亡。目前,Didemin B,已能够人工全合成。,海鞘来源的抗癌肽,Didemnin B,23,海兔体内存在着多种结构独特、生理功能各异的次生代谢产物，如萜类、毒素、甾体、大环内酯及肽类等，其中肽类化合物尤为引人注目。其中,Dolastatin15,和,Dolastatin 10,主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。,海兔来源的抗癌作用肽,24,海 洋 生 物,1,海藻类：,已知的海藻有,1,万多种,海洋动物类：,腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类,2,海洋微生物：,3,25,第一节 氨基酸类药物,26,本节内容,氨基酸的种类,氨基酸类药物的制造方法,27,氨基酸输液,氨基酸的分类,1,蛋白质氨基酸：,编码氨基酸,非蛋白氨基酸：,D,型氨基酸、,-,氨基酸、,-,氨基酸等,2,衍生氨基酸：,5-,羟色胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等,必需氨基酸和非必需氨基酸：,亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。,28,29,八种必需氨基酸：,携一两本黄色书来,携,-,缬氨酸,一,-,异亮氨酸,两,-,亮氨酸,本,-,苯丙氨酸,黄,-,甲硫氨酸（硫为黄色）,色,-,色氨酸,书,-,苏氨酸,来,-,赖氨酸,氨基酸记忆口诀,30,六伴穷光蛋：,硫、半、光、蛋半胱、光、蛋（甲硫）氨酸含硫氨基酸,酸谷天出门：,酸、谷、天谷氨酸、天门冬氨酸酸性氨基酸,死猪肝色脸：,丝、组、甘、色氨酸一碳单位来源的氨基酸,只携一两钱：,支、缬、异亮、亮缬、异亮、亮氨酸支链氨基酸,一本落色书：,异、苯、酪、色、苏异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸生糖兼生酮,拣来精读之：,碱、赖、精、组赖氨酸、精氨酸、组氨酸碱性氨基酸,芳香老本色：,芳香、酪、苯、色酪、苯丙色氨酸芳香族氨基酸,不抢甘肃来：,脯、羟、甘、苏、赖脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸不参与转氨基的氨基酸,所有氨基酸：,六伴穷光蛋，,酸谷天出门，,死猪肝色脸，,只携一两钱。,一本落色书，,拣来精读之。,芳香老本色，,不抢甘肃来。,蛋白质水解法：,胱氨酸、半胱氨酸,化学合成法：,甘氨酸、蛋氨酸、丙氨,酸、苯丙氨酸、丝氨酸等,发酵法：,苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、亮氨酸等,酶法：,丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等,氨基酸类药物的制造方法,重点,31,基本原理：,以毛发等蛋白质为原料，通过,酸、碱或酶,水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法,。,*主要过程：,水解、分离和结晶精制。,32,蛋白质水解法,品种：,L-,胱氨酸、,L,精氨酸、,L,亮氨酸、,L-,异亮氨酸、,L-,组氨酸、,L-,脯氨酸及,L-,丝氨酸等。,酸水解法：,水解迅速而彻底，无消旋作用；,色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基，且产生大量废液污染环境。,碱水解法：,水解迅速而彻底，色氨酸不被破坏；,含羟基或巯基的氨基酸全被破坏，且产生消旋，工业上多不采用。,酶水解法：,反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不被破坏，无消旋作用；,水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含有多肽。工业上主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。,蛋白质水解法,重点,33,发酵的基本原理,借助微生物在有氧或无氧条件下进行生命活动制备微生物菌体或其代谢产物的过程。,发酵法,34,菌种诱变与选育,种子制备,发酵培养,产物分离纯化,发酵的基本过程,35,培养基配制与灭菌,缺点,产物浓度低，设备投资大，生产周期长，成本高。,*绝大部分氨基酸可通过发酵法生产，有些由于得率低，未实现工业化生产。,36,基本原理：,又称酶工程技术，是在特定酶的作用下使某些有机物转化成相应氨基酸的技术。,*,主要过程,前体合成,菌体培养,转化反应,产品纯化与精制,酶转化法,37,微生物,植物细胞,动物细胞,化学合成，生物合成，天然存在,底 物,（,AA,前体）,生物反应器,含,L-AA,反应液,L-AA,酶转化法生产,L-AA,流程,38,结 构,分子量,等电点,性 质,溶解性,L-Asp,L-Ala,L-Asp,和,L-Ala,的结构与性质,133.10,89.09,2.77,6.0,酸性氨基酸,中性氨基酸,溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚,在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚,39,+CO,2,天冬氨酸酶,L-Asp,脱羧酶,酶转化反应,工艺路线,固定化,L-Asp,脱羧酶,转化液,B,延胡索酸,+NH,3,固定化 天冬氨酸酶,转化液,A,L-Asp,粗品,L-Asp,精品,L-Ala,粗品,L-Ala,精品,40,泵,储,罐,反应产物,离心机,母液回收,固定化酶柱子,a,晶体,L-Asp,L-Asp,延胡索酸氨盐,工 艺 路 线,41,*,优点,工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少，固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可反复使用。,*,缺点,固定化细胞或固定化酶代价高。,42,以酸、醛、酯及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩和、取代及氢化还原等化学反应合成,-,氨基酸的方法称为,化学合成法。,化学合成法,43,*,特点,理论上所有氨基酸均可由化学合成法制造，但只有当采用其他方法生产很不经济时才采用化学合成法生产。,44,2005,版中国药典收载的氨基酸原料药,氨基酸输液,45,氨基酸输液,多种结晶,L-,氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称为氨基酸输液当由于疾病等原因，不能经口摄取的时候，把纯度高的氨基酸混合液作为最合适的氮源，从静脉注入身体是比较合理的营养补给方法。,氨基酸输液的组方原理与配方模式,46,不同类型的,AA,输液，根据在临床上的用途不同,可以分为以下几类,：,47,思考题,氨基酸类药物的制造方法有哪些？简述其原理及其过程？,蛋白质水解法有哪些？各有何优缺点？,48,第二节 多肽与蛋白质类药物,49,本节内容,多肽与蛋白质类药物概述,多肽与蛋白质类药物的制造方法,50,重要的多肽与蛋白质类药物的制备,51,多肽类药物分类,多肽激素,垂体多肽激素,促皮质素（,ACTH,）、促黑激素（,MSH,）、脂肪水解激 素（,LPH,）催产素（,OT,），加压素（,AVP,）等,下丘脑激素,促甲状腺激素释放激素（,TRH,）、生长素抑制激素（,GRIF,）、促性腺激素释放激素（,LHRH,）,甲状腺激素,甲状旁腺激素（,PTH,）、降钙素（,CT,）,胰岛激素,胰高血糖素、胰解痉多肽,胃肠道激素,胃泌素、胆囊收缩素促胰酶素（,CCK-PZ,）、肠泌素、肠血管活性肽（,VIP,）、抑胃素（,GIP,）、缓激肽、,P,物质,胸腺激素,胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子,52,多肽类细胞生长调节因子,表皮生长因子（,EGF,），转移因子（,TF,），心钠素（,ANP,）等。,含有多肽成分的其它生化药物,骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、脑氨肽、蜂毒、蛇毒,、,胚胎素、助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。,多肽类药物分类,53,蛋白质激素,垂体蛋白质激素,生长素（,GH,），催乳激素（,PRL,），促甲状腺素（,TSH,），促黄体生成激素（,LH,），促卵泡激素（,FSH,）。,促性腺激素,人绒毛膜促性腺激素（,HCG,），绝经尿促性腺激素（,HMG,），血清性促性腺激素（,SGH,）。,胰岛素及其他蛋白质激素,胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。,血浆蛋白质,白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（,FN,）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，,Veil,s,病免疫球蛋白抗,D,免疫球蛋白，抗,HBs,免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶,，凝血因子,，凝血因子,。,蛋白质类药物分类,54,蛋白质类细胞,生长调节因子,干扰素,、,、,（,IFN,）,白细胞介素,1,7,（,IL,），神经生长因子（,NGF,），肝细胞生长因子（,HGF,），血小板衍生的生长因子（,PDGF,），肿瘤坏死因子,(TNF),，集落刺激因子,(CSF),，组织纤溶酶原激活因子,(tPA),，促红细胞生成素,(EPO),，骨发生蛋白（,BMP,）。,粘蛋白,胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。,胶原蛋白,明胶、阿胶等,碱性蛋白质,硫酸鱼精蛋白,蛋白酶抑制剂,胰蛋白酶抑制剂,凝集素,PHA,、,ConA,蛋白质类药物分类,55,提取分离纯化法（重点）,化学合成法,基因工程法,多肽与蛋白质类药物的制造方法,重点,56,原料选择,上 清,破碎 提取,沉 淀,变性 复性,蛋白质纯化,蛋白质药物,Separation and Purification,纯度 活性鉴定,合格,不合格,精品,发 酵,生物 组织,57,重点,Protein-Separation,原则：富含所需蛋白质多肽成分的，易于获得、易于提取、无害（原核、真核发酵；生物组织）,注意事项：种属、发育生长阶段、原料的环境、解剖部位、生物状态,溶解性 稳定性 合适的溶剂,原料选择,提取,58,重点,蛋白的提取,清蛋白,可溶于稀盐、稀酸、稀碱。,可被饱和硫酸铵沉淀。,eg:,白蛋白，卵清蛋白,球蛋白,不溶于水但溶于稀盐，可以被,半饱和的硫酸铵沉淀。,eg:IgG,，肌球蛋白,谷蛋白,不溶于水、醇和中性盐溶液，,但溶于稀酸或稀碱。,eg:,米谷蛋白,谷醇溶蛋白,不溶于水及无水乙醇，但溶于,70-80%,乙醇中。非极性侧链多,eg:,小麦醇溶蛋白,组蛋白,溶于水和稀酸，但可被稀氨水,沉淀，分子中含,His,、,Lys,多。,eg:,小牛胸腺组蛋白,鱼精蛋白,溶于水及稀酸，不溶于氨水，,分子呈碱性。,eg:,鲑精蛋白,硬蛋白,不溶于水、稀酸、稀碱、盐。,有较强机械强度。,eg:,角蛋白，胶原,Protein-Purification,纯化,根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。,1.,根据蛋白质的,pI,的不同进行纯化，其方法有：,1,）,pI,沉淀法,2,）,pI,沉淀法与盐析法相结合,3,）,等电聚焦法,2.,蛋白质,分子形状和大小,的不同进行纯化，其方法有,1,）,凝胶过滤,2,）,超滤法,3,）离心法,4,）,透析法,3.,蛋白质的,溶解度,不同进行纯化，其方法有：,a),盐溶与盐析法,b,）结晶法,c,）,有机溶剂沉淀法,4.,蛋白质,电离性质不同进行,分离：,离子交换法,5.,蛋白质,功能专一性,不同进行纯化：,亲和层析法,6.,蛋白质,在溶剂系统中分配,不同进行纯化：萃取法,7.,蛋白质的选择性吸附,的性质进行纯化：吸附法,8.,蛋白质的,其他特殊性质,进行纯化,60,重点,蛋白质两性解离性质和等电点,pH=pI,净电荷=0,pH,pI,净电荷为负,Pr,COOH,NH,3,+,+,H,+,+,OH,-,+,H,+,+,OH,-,Pr,COO,-,NH,2,Pr,COO,-,NH,3,+,当蛋白质溶液在某一定,pH,值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的,pH,值即为该蛋白质的,等电点,（,isoelectric point，,pI,）,等电聚焦电泳（,Isoelectric focusing,IEF,）,Isoelectric focusing,凝胶过滤层析,Gel filtration chromatography,超滤,（,ultrafiltration,）,原理,:,是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质留在半透膜上，以达到浓缩和脱盐的目的,透析（,dialysis,）,原理：,利用,蛋白质分子不能通过半透,而将其与小分子物质分开,常用的半透膜为,玻璃纸,或,纤维素材料,按照,分子大小,进行分离，分离取决于透析袋截留的分子量。,透析,只用来除盐类和小分子杂质,盐析,(,salt precipitation),原理：,将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质,表面电荷被中和以及水化膜被破坏,，导致蛋白质沉淀。,盐溶,原理：,分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，,加入少量盐离子,后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中,有机溶剂分级沉淀,脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间相互作用。,载体,功能基团,平衡离子,离子交换剂,阳离子交换树脂：平衡离子带正电荷,阴离子交换树脂：平衡离子带负电荷,阳离子交换层析过程,离子交换树脂,蛋白质,高离子强度洗脱液洗,高离子强度洗脱液洗,加样,平衡液洗,收集,离子交换层析（,Ion exchange,）,Affinity chromatography,分离纯化方法的选择,1.,分离纯化早期使用方法的选择,特点：,提取液中的物质十分复杂，目的蛋白浓度较稀。,方法选择原则,：,低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。,2.,各种分离纯化方法的使用顺序,原则,：,相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的安排上要考虑到有利于减少工序，提高效率。,3.,分离纯化后期的保护性措施,4,对每一步骤方法的优劣进行综合评价,每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了,从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注,意方法本身的回收率的高低。,78,重点,纯化方法选择指南,79,多肽与蛋白质的化学合成概述,合成原理：是一个重复添加,AA,的过程，一般自,C,端向,N,端合成,。,合成方法,：（,1,）液相合成,（,2,）固相合成,（,1963,年,R.B.Merrifield,创立，并因此获,1984,年,诺贝尔化学奖）,1953,年,Du.Vigneaud,等合成,催产素,（,oxytocin,OXT,，,9AA,单链肽）,1963,年,合成促肾上腺皮质激素,（,ACTH,，,39AA,单链肽）,1965,年,中国科学家合成了胰岛素,（,Insulin,，,51AA,双链肽）,80,多肽合成的主要步骤,氨基的保护和羧基的活化,羧基的保护和氨基的活化,接肽和去保护基,氨基保护基,苄氧羰基,强酸脱除,叔丁氧羰基（,BOC,）,三氟乙酸（,TFA,）脱除,9-,芴甲氧羰基（,Fmoc,）,碱脱除,81,多肽的固相合成（,Fmoc,保护法）,（,1978,年改进的方法，避免了强酸处理）,82,N,N-,二环已基碳酰亚胺,9-,芴甲氧羰基,胰岛素,胰腺是人体重要的消化器官，主要包括分泌消化酶为主的外分泌细胞和导管系统，及由多种内分泌细胞组成的胰岛。,胰岛素是由胰岛中,细胞分泌的肽类激素，分子结构为,51,个氨基酸组成有两个二硫键连接的,2,条肽链。,胰岛素单体,胰岛,胰腺,83,胰岛素的合成与分泌,细胞最初生成胰岛素原，后经分泌小泡运送到细胞膜，由胞吐作用经细胞膜释放入血。释放过程中脱去一段,C,肽，形成,A,、,B,链结构的胰岛素。,血液中内生胰岛素和,C,肽的比例是对等的。,胰岛素原,C,肽,B,链,A,链,C,肽,B,链,84,胰岛素的结构,胰岛素的两个肽链分别为,21,个氨基酸组成的,A,链和,30,个氨基酸组成的,B,链。,氨基酸排列有种属差异。,猪胰岛素与人胰岛素仅在,B,链第,30,位氨基酸上有所不同，牛胰岛素在,A,链上还有两个氨基酸不同。,人胰岛素的一级结构,85,猪胰岛素,牛胰岛素,赖脯人胰岛素（礼来公司、速效,Ins,）,门冬胰岛素,（诺和诺德公司、速效,Ins,）,甘精胰岛素,(,安万特公司、长效,Ins),人胰岛素（,Insulin,）,B30,A8 ;A10 ;B30,B28 ;B29,B28,A21 ;B31 ;B32,86,胰岛素,用,X,线衍射法测出猪胰岛素晶体的立体结构为,(,中国，,1971),：六个胰岛素分子和两个锌离子的胰岛素六聚体。,两个胰岛素分子形成二聚体，三个二聚体围绕着三重轴形成对称排列的六聚体。,作为胰岛素的储存形式，在胰岛素制剂注射到人体内也需要经过由六聚体解离为二聚体，再分解为单体释放入血液被利用的过程。,胰岛素六聚体的三维结构图,87,3D Structure of Insulin,胰岛素二聚体（,dimer,）,胰岛素六聚体（,hexamer,）,88,20,世纪末,人胰岛素类似物研制成功,胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力，故治疗时需提前,20-30,分钟注射胰岛素。,糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛素制剂。,利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合。,89,目前临床使用的胰岛素来源,动物胰脏来源,-,经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素,半合成胰岛素,-,以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素,重组,DNA,技术生产胰岛素,（现阶段临床最常用）,-,重组,DNA,技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素,90,动物来源的胰岛素,（,28,种）,药品名称,生产企业,药品名称,生产企业,ILETIN I,LILLY,NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN,NOVO NORDISK INC,ILETIN II,LILLY,PROTAMINE ZINC&ILETIN I(BEEF-PORK),LILLY,INSULIN,NOVO NORDISK INC,PROTAMINE ZINC AND ILETIN II,LILLY,INSULIN INSULATARD NPH NORDISK,NOVO NORDISK INC,PROTAMINE ZINC AND ILETIN II(PORK),LILLY,INSULIN NORDISK MIXTARD(PORK),NOVO NORDISK INC,PROTAMINE ZINC INSULIN,BRISTOL MYERS SQUIBBLENTARD,NOVO NORDISK INC,REGULAR ILETIN II,LILLY,LENTE,NOVO NORDISK INC,REGULAR ILETIN II(PORK),LILLY,LENTE ILETIN II,LILLY,REGULAR PURIFIED PORK INSULIN,NOVO NORDISK INC,LENTE ILETIN II(PORK),LILLY,REGULAR INSULIN,NOVO NORDISK INC,LENTE INSULIN,NOVO NORDISK INC,SEMILENTE,NOVO NORDISK INC,NPH ILETIN I(BEEF-PORK),LILLY,SEMILENTE INSULIN,NOVO NORDISK INC,NPH ILETIN II,LILLY,ULTRALENTE,NOVO NORDISK INC,NPH ILETIN II(PORK),LILLY,ULTRALENTE INSULIN,NOVO NORDISK INC,NPH INSULIN,NOVO NORDISK INC,VELOSULIN,NOVO NORDISK INC,91,半合成来源的胰岛素（,5,种）,药品名称,生产企业,INSULATARD NPH HUMAN,NOVO NORDISK INC,MIXTARD HUMAN 70/30,BAYER PHARMS,NOVOLIN 70/30,NOVO NORDISK INC,NOVOLIN L,NOVO NORDISK INC,NOVOLIN N,NOVO NORDISK INC,92,基因重组来源的胰岛素,（,27,种）,药品名称,生产企业,药品名称,生产企业,APIDRA,SANOFI AVENTIS US,LANTUS,SANOFI AVENTIS US,EXUBERA,PFIZER,LEVEMIR,Novo Nordisk,HUMALOG,LILLY,MIXTARD HUMAN 70/30,BAYER PHARMS,HUMALOG MIX 50/50,LILLY,NOVOLIN 70/30,Novo Nordisk,HUMALOG MIX 75/25,LILLY,NOVOLIN L,NOVO NORDISK INC,HUMALOG PEN,LILLY,NOVOLIN N,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 50/50,LILLY,NOVOLIN R,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 70/30,LILLY,NOVOLIN R,（,Purified,）,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 70/30 PEN,LILLY,NOVOLOG,NOVO NORDISK INC,HUMULIN BR,LILLY,NOVOLOG MIX 70/30,NOVO NORDISK INC,HUMULIN L,LILLY,VELOSULIN BR,NOVO NORDISK INC,HUMULIN N,LILLY,VELOSULIN BR HUMAN,NOVO NORDISK INC,HUMULIN R,LILLY,HUMULIN U,LILLY,HUMULIN R PEN,LILLY,93,通化东宝,1998,年,12,月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖”,甘舒霖,R-常规重组人胰岛素注射液,甘舒霖,N-低精蛋白重组人胰岛素注射液,甘舒霖,30R-30/70混合重组人胰岛素注射液,（,30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素,）,深圳科兴,苏泌啉,-常规重组人胰岛素注射液,苏泌啉恩,-低精蛋白重组人胰岛素注射液,徐州万邦,万邦林,-常规重组人胰岛素注射液,万苏林,猪胰岛素制剂,胰岛素国内主要生产厂家,其他,（持有药品注册证）,-,南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化制药厂、武汉生化制药厂 等。,94,临床用胰岛素分类,普通胰岛素：从动物胰脏中提取,人胰岛素,传统中长效胰岛素,长效人胰岛素类似物,速效人胰岛素类似物,非注射胰岛素,95,传统中长效胰岛素制剂,低精蛋白锌胰岛素：,胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。,例：,礼来公司，,Humulin N(rDNA,、大肠杆菌,),诺和诺德，,Novolin N(rDNA,、酿酒酵母,),胰岛素锌混悬液,：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液,例：,礼来公司，,Humulin 30/70(30%,常规胰岛素，,70%,精蛋白锌胰岛素,)Humulin 50/50,诺和诺德，,Novolin 30/70,Novolin 50/50,缺陷,：,作用时间少于,24,小时,作用峰值明显，夜间低血糖危险性高,吸收不稳定,结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素在玻璃瓶壁沉淀，丧失活性,96,长效胰岛素,-,人胰岛素类似物,1,.,甘精胰岛素,（,glargine,）：商品名,Lantus,-,甘氨酸替代胰岛素,A,链,21,位门冬氨酸、并在,B,链末端增加两,个精氨酸。,使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由,5.4,上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。,2.Insulin Detemir,：,商品名,Levemir,-,胰岛素,B,链,29,位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个,N-16-,烷基,酸的,14,碳游离脂肪酸,该,游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。,97,Insulin Detemir,（,Levemir,）,诺和诺德公司研制,glargine,（,Lantus,）,法国安万特公司研制,98,速效胰岛素,特点：,起效快，皮下注射后,15,分钟起效。,达峰快，注射后,15,分钟起效，,30,60,分钟达到药效高峰。,药效维持时间短，大约在,3,小时左右（,2,4,小时）,。,药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。,起效时间,达峰时间,峰持续时间,作用消除时间,常规皮下,Ins:,30-90min,1.5-2.5h,2-4h,6-8h,生理,Ins,：,0-20min,30-45min,2-3h,3-4h,99,B,26-30,对于胰岛素结合于胰岛素受体的功能无关，但是对胰岛素形成二聚体有关的结构特点。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降但是与胰岛素受体结合能力不变的新型速效胰岛素类似物。,研制机理,已上市药物,：,Lispro,、,Aspart,、,Apidra,100,Lispro,（赖脯胰岛素，,Humalog,）,是第一个用于临床的速效胰岛素类似物，由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的,B28,与,B29,位的氨基酸对换。,101,A 1,B 1,21,30,29 28,28 29,lispro,优泌乐,赖脯胰岛素,Aspart,（门冬胰岛素，,Novolog,）,由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了,B,链,28,位上的脯氨酸。,102,A,1,B,1,21,30,天门冬氨酸,脯氨酸,aspart,诺和锐,门冬胰岛素,诺和锐,30,特充,APIDRA,（赖谷胰岛素，,Apidra,）,安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素,B3,位的天冬氨酸和,B29,位的赖氨酸,。,103,胰岛素肺部吸入制剂,-Exubera,美国辉瑞、,Nektar,公司以及法国万安特共同研发于,2006.1.27,被,FDA,批准,一种作用快的胰岛素干粉吸入剂,适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征,104,非注射用胰岛素,正在研究中的其它非注射胰岛素给药途径包括,:,口腔喷雾 鼻腔给药 直肠栓剂给药 均还在研究阶段 滴眼剂 透皮或口腔粘膜给药,105,胰岛素注射方式的改进,几十年来,胰岛素注射器已经有了很大的改进。许多品牌厂商制造胰岛素专用注射器,针头经过特殊处理,因而,注射时不感到疼痛,而且针眼很小,。注射器针筒上直接标有胰岛素单位,(IU),，注射几个单位胰岛素只要按标记抽取,不需换算。,一次性注射器,106,胰岛素注射方式的改进,一种利用高压将胰岛素“喷”入皮下的装置，,无需针头,，加之其经久耐用，常给惧怕针头的儿童使用。但此装置,价格较贵,，,拆洗安装过程较繁琐,，,喷射时局部压力较大,，,尚未广泛推广使用,。目前高压注射器多用于人群计划免疫和多人集中注射的情况。,高压无针注射仪,107,胰岛素注射方式的改进,胰岛素笔是一种形如钢笔的专用注射装置,将胰岛素液储存于笔中,使用前调好剂量旋钮,患者自己注射方便易行,。,胰岛素笔配有专用笔盒,可随身携,带,更方便于旅行出差时使用。,笔上配有触感式剂量调整旋纽，也能适用于眼睛不方便的患者。,胰岛素笔,108,胰岛素注射方式的改进,胰岛素泵是目前最方便、最现代化的注射方式，,可以自动定时定量地注射胰岛素,，,能较好模拟生理性胰岛素分泌,，可以准确控制胰岛素的输入剂量，并能经导管连续不断按需要将胰岛素输入患者皮下。随着技术的发展，胰岛素泵越发小巧，功能亦不断完善，目前的胰岛素泵仅重约,100,克,如一台寻呼机大小，携带方便。,胰岛素泵,109,胰岛素制备工艺,以动物胰脏为原料提取胰岛素,-,酸醇提取法,传统胰岛素,-,猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶,单峰胰岛素,-,凝胶过滤纯化,单组分胰岛素,-,凝胶过滤、离子交换纯化,半合成胰岛素,-,以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素,重组,DNA,技术生产人胰岛素,AB,链合成：分别表达,AB,链，化学方法连接,逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素,重点,110,Ins,的性质,111,Insulin crystas,酸醇提取法提取动物胰岛素,112,注意事项,113,酶促半合成人胰岛素,114,重组,DNA,技术制造人胰岛素,AB,链合成法：,以人工合成的人胰岛素,A,链和,B,链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融合基因，分别在大肠杆菌中表达,A,链和,B,链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。,反转录酶法：,通过胰岛素原的,cDNA,合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去,C-,肽得人胰岛素。,115,Ins A,链,Ins B,链,转化大肠杆菌,发酵,A,链,B,链,纯化,二硫键,活性胰岛素,AB,链合成人胰岛素,116,质粒,Ins mRNA,反转录,Ins cDNA,转化大肠杆菌,PCR,连接,胰岛素原,活性胰岛素,二硫键,酶切,提取质粒,限制性内切酶酶切,反转录酶法合成人胰岛素,117,思考题,目前多肽和蛋白质类药物的制造方法有哪些？,提取分离纯化法生产多肽和蛋白质类药物包括哪些过程？有哪些注意事项？,目前胰岛素的制备方法有哪些？,118,第三节 核酸类药物,Nucleic acid Medicine,119,本节内容,核酸类药物概述,核酸类物质的分离提取及其发酵生产,120,重要的核酸类药物的制备,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,DNA,：,AGCT,RNA,：,AGCU,RNA,：,D-,核糖,DNA,：,D-,脱氧核糖,121,一、核酸类药物概述,（一）,依据化学结构和组成分类：分四类,核酸碱基及其衍生物,1,核苷及其衍生物,2,核苷酸及其衍生物,3,多核苷酸,4,122,123,抑制尿酸合成，,解热镇痛抗炎,1,、核酸碱基及其衍生物,别嘌呤醇（,Allopurinol,）,、巯嘌呤Mercaptopurine,）、磺硫嘌呤（,Tisupurine,）、氟尿嘧啶等,2,、核苷及其衍生物,腺苷类：,腺苷、腺苷甲硫氨酸（,SAM,）、阿糖腺苷,(Ara-A),等,尿苷类：,尿苷、呋喃氟尿嘧啶、氮杂尿苷（,Azauridine,）等,胞苷类：,阿糖胞苷（,Ara-C,）、环胞苷、氮杂胞苷等,肌苷类：,肌苷、肌苷二醛、异丙肌苷等,脱氧核苷类：,氮杂脱氧核苷、脱氧硫鸟苷等,124,3.,核苷酸及其衍生物,单核苷酸类：,AMP,、,UMP,、,IMP,、,cAMP,、,CoA,等,核苷二磷酸类：,尿二磷葡萄糖（,UDPG,）、胞二磷胆碱（,CDP-Choline),等,核苷三磷酸类：,ATP,、,CTP,、,UTP,、,GTP,等,核苷酸类混合物：,5,核苷酸、,2,核苷酸、,3,核苷酸等,4.,多核苷酸,二核苷酸：,Co,、,Co,、黄素腺嘌呤二核苷酸（,FAD,）,多核苷酸类：,RNA,、,DNA,、,poly I:C,、,poly A:U,、转移因子（,TF,）等,（二）,依据结构特点及临床应用情况分类,1,、具有天然结构的核酸类物质,如：肌苷、,ATP,、,GTP,、,CTP,、,UTP,、,Co I,等,来源：,提取或发酵,特点：,毒副作用小,用途：,有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，临床已广泛应用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、