生物物理学导论PPT文档.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章,生物的结构和功能,1,3.1 生物大分子的 物理结构测定,生物大分子的分子量都远大于10000。,生物大分子以各种方式参与活细胞中的许多反应，这些反应的进程和调控都有赖于它们的排布和结构。,知道生物大分子的大小、形状以及精细结构，对于了解它们的功能包括它们的反应过程，是非常重要的。,许多技术用于测定这些结构，,2,3,渗透压,对稀溶液，渗透压,P遵,从范特霍夫（Vant Hoff）关系,式中，,V,是体积，,n,是克分子数，,C,是浓 度，,R,是气体常数，,T,是绝对温度。实验证明，这一关系式能精确地描述浓度不超过1的情况。,4,范特霍夫定律面临的挑战,对于大分子(如聚苯橡胶)，既是非稀的溶液，观测到的结果也偏离范特霍夫关系。产生的问题是：,(1)如何测定不服从范特霍夫定律的分子的分子量？,(2)怎样基于渗透压数据来测定大分子的大小和形状？,5,非电解质溶液的渗透压,1954年，Mc Millan&Mayer证明，非电解质溶液的渗透压,P,可以表达为以克立方厘米为单位的浓度C的幂级数：,式中，,M,是溶质分子的分子量，,a,2,a,3,是独立于,C,的系数。,6,相当稀的大分子溶液,对相当稀的大分子溶液，第三项和高次项都可以忽略不计，从而上式可以重新写作,当测定了不同浓度值,C,的渗透压,P,时，作出,P/C,随,C,变化的图，在低,C,值将得到一条直线。在,C 0,时，从直线的截距即可测得分子量,M,。,7,光散射,瑞利(Rayleigh)用大小比入射光波长更小的各向同性微粒，建立了光散射理论。根据瑞利理论，在角度,的散射光强度,I,，与距放射体积,R,s,处观测到的光强度,I,q,和入射光强度,I,0,之间的关系是,式中，,R,q,是瑞利比的系数，由下式给出,这里,是微粒的极化率。,8,大分子稀溶液的瑞利系数,当微粒的大小与波长相比，不是很小时，这一理论就变得更为复杂了，因为这时就要考虑在微粒不同部份散射光的干涉效应。在瑞利理论的推广中，德拜(Debye)于1947年证明，对于大分子的稀溶液，瑞利系数由下式给出,式中，,C,是以克立方厘米为单位的浓度，,M,是分子量，,K,是浓度、溶剂和溶液的折射指数以及波长的函数。,9,浓溶液的,M,值,对于更浓的溶液,下列关系式给出更准确的,M,值，,分子大小的影响可以考虑微粒散射因子,P,(,),，,由此得到,散射数据可以由测量在不同散射角,和物质浓度,C,处的散射光，外推到零角度和零浓度获得。由此即可求得,M,值。光散射测量也用于确定扩散常数。,10,3.2 扩散,11,摩擦和粘度,当大分子一速度,v,通过一液体时，它们受到一摩擦力,摩擦系数,f,与分子的大小、形状和液体的粘度,有关。如果我们可以确定,f,，,而且分子的成份和浓度也知道，则只要能从外形参数确定克分子体积，我们就可以计算分子量。,12,斯托克斯(Stokes)定律,克分子体积只有对球状分子和椭球分子才可以确定；对球状分子，斯托克斯(Stokes)定律,式中,a,是分子的半径；对椭球分子，可以导出类似的关系。对于更加复杂形状，要利用近似来得到克分子体积的估算值。,13,扩散,为了确定,f,，我们必须使分子通过一介质移动。这可利用扩散过程或通过沉降来达到，扩散过程中运动的驱动力由浓度梯度提供，沉降中的驱动力是重力或离心力。,扩散是分子无规运动的直接结果。,14,费克(Pick)定律,如果在容器中有一高浓度区，则纯无规运动将使分子超出这一区域而进入低浓度区。费克(Pick)定律指出，如,dn/dt,是每单位时间在一维通过截面,A的,分子数，则,式中，是一维)浓度梯度，,D,是扩散常数。这一扩散常数与擦系数相关,式中,k,是波尔兹曼常数，,T,是绝对温度。,15,扩散方程,两个容器，一个注满初始浓度,C=C,0,的溶液，另一个装满溶剂(,C 0,)，它们可以移动，以便在时间,t0,使两者彼此接触。由于在这一实验中扩散分子的数量保持一定，所以，在界面,A,和长度,dx,的范围中浓度的增加就是扩散进入这一范围的过量物质。这导出扩散方程,16,扩散常数测量的实验装置,17,由这一实验确定的边界条件(对,t0,)是，对,x,0，,c,0；对,x0,c,c,0,。方程的解是概率积分,其值被广泛地列成表。从上式可得出浓度梯度,18,图给出了在不同,t,值，浓度(a)和浓度梯度(b)随,x,变化的情况。扩散在图所示的实验装置中将以光学方法来跟踪，扩散常数D将从概率积分表计算。,19,用激光技术测量扩散常数,光散射光谱学的发展已开始使用激光技术测量扩散常数。散射的(原初相干的)激光的线宽,等于,式中,K,0,是散射矢量，这一矢量由下式给出,式中，,K,0,是入射激光的波矢量，,是散射角。,20,用激光技术测量扩散常数的优点,通过测定在不同散射角放射激光的线宽,，并用,对|,K,|,2,作图，就有可能直接和精确地确定,D,。,不再需要建立浓度梯度以开始扩散，,无须回避机械扰动、温度梯度以及分子或微粒上的电荷带来的复杂性。,21,3.3 沉降,22,引力,微粒或大分子的质量，通常是通过观测它们在重力、离心力这样的外力影响下的运动来测定。,在引力场中，微粒的热运动速度，由引力与流动介质阻滞微粒运动的摩擦力之间的平衡来决定。,引力是微粒的重量与因流动介质移动而产生的浮力之间的差，等于,mg-V,0,g,；这里，,m,是微粒的质量，,V,是其体积，,0,是流动介质的密度。,23,微粒沉降的匀速度,由于,Vm,，这里,是微粒的密度，所以引力可以写作,当这一力与摩擦力平衡时，微粒沉降的匀速度为,一般，引力场的微弱，限制了在这样的场中观测微粒的沉降，特别是对非常粗大的颗粒更是如此。,24,离心,离心技术可产生高达300,000 g的“引力场”，使这一方法足以适应致蛋白质这样的大分子以及较小分子的需要。,在这种情况下，式上中的,g,被,2,r,替换，其中,是离心的角速度,r,是微粒与旋转中心问的距离,微粒沉降的匀速度,v,为,25,沉降常数,对一定的溶剂中给定的分子种类，沉降常数,是一特征常数单位是斯。1斯=10,-13,秒，联立上述两式,由于，仅对球体或椭球体是确定的，所以可通过附加测量这样一些办法来去掉它。,26,质量,m,和分子量,M,当扩散常数已知时，我们可以用关系式,给出质量,m,即,给出分子量,M,即,27,表32列出了一些分于在20C的沉降常数、扩散常数、分子量和密度的倒数(或比容)。,28,29,沉降率和沉降平衡,分于的沉降率可以通过在分析离心机中转动分了的悬浮液(溶液)(图33)，并观测移动的界面来测定。利用大家熟知的施列仑(Schlierenr)光学这样的特殊光学装置，人们可以按浓度梯度记录界面。由此，就可以获得典型的施利仑图样的照片。图34示出了从大肠杆菌(,E.coli,)核糖体制剂得到的这种照片。,30,离心机模式图,31,32,微粒沉降的速率,在沉降平衡时，微粒(分子)离开转轴运动的速率正好等于因浓度梯度而使其朝相反方向运动的速率。微粒沉降的速率(每单位面积)等于沉降速度乘上浓度：,微粒反向扩散的速率(每单位面积)由费克定律给出,33,分子量的表达式,在平衡时，微粒沉降的速率等于微粒反向扩散的速率，于是得到,在,r,1,到,r,2,之间对上述微分方程积分可得,分子量的表达式是独立于微粒（分子）的大小和形状。,34,平衡值的测量,沉降平横法并不需要独立测量D以决定分子量。但是，达到平衡状态所需要的时间特别长，所以，对分子量大于5000的物质，这一方法就不实用了。,一个改进的方法是：在液面和离心管的底部不可能有任何净流量。平衡状态就是在所有时间都没有净流量通过溶液中的任何平面，所以，在离心机加速后不久测量液表面和离心管底面的浓度，就可用以给出平衡值。,35,密度梯度,若离心一低分子量物质(如蔗糖)，则在平衡时有一密度梯度穿过离心管。,如果将一高分子量物质加入离心管，则它将悬浮于这一有不同密度的溶液中的特定位置，在这一位置其浮体密度等于溶液密度。,如物质是由分子量不同的各种成份组成的，则每种组份将在溶液的特定平面以条带的形式分离出来。,这一分离方法称为密度梯度法，它广泛用于生化和生物物理研究中，而且在像分离较高等植物光合作用中两个光化学系统的大分子组分这样的工作中也非常有成效。,36,3.4 X射线晶体结构分析,37,1.X射线衍射,当散射单位的面间距足够小时，x射线的衍射可发生。由于晶体是一单位结构(单胞)的规则排列，所以，当x射线的波长与晶体中原子间的距离有同一数量级时，x射线就会被晶体衍射。1912年，劳埃(M ax von Laue)小组在德国证明了这一结果。,若有一束x射线投射在晶体中带有重复距离,a,的一列散射单位(如原子)上，则可得到在由下式给出的方向,有衍射极大的衍射花样,38,39,2.布喇格关系式,在散射单位的三维排列中，获得的衍射极大的花样过于复杂，以致无法按上述理论的三维推广来分析。,布喇格父子(W.H.Bragg和W.L.Bragg)发展了一种方法，其基本思想就是将三维的问题简化为二维的问题。他们证明，散射x射线可以看作来自晶体中由单独的放射单位组成的平面的反射。,40,41,在上图中，平面由联接一行散射单位的直线标出；入射x光与这些平面成角,，它在相等的角度,被反射出来。如两相邻平面间的距离为,d,，当光程差为波长的整倍数时，发生相长干涉(constructive interference)。由此，在下式给出的方向,观察到衍射极大,这称为布喇格关系式,42,产生衍射极大的条件,在一带单色x射线的静置的系统中，在(1)式中，在给定的散射角,，在任何入射角以及任何彼此协调的,a,和,值，都可产生衍射极大。,在一带单色,x,射线的静置的系统中，在(2)式中，量,d,、,和,都是确定的；相反，但按(2)式，仅当入射,x,光与一套平面成角,满足布喇格关系式时，才产生衍射极大。,尽管在晶体中可以各种取向构成平面，但一般说来，在固定的入射方向上并没有衍射极大产生。,43,获得晶体的x射线衍射花样的途径,(a)用非单色X光，使方程,中的 值是可变的。这样得到的衍射花样称为劳埃花样。由于 值不确定，从劳埃花样可得的信息是有限的。,44,(b)用单色x光(用合适的吸收滤片如Ni，选取特征辐射的一条线，如Cu的K线获得),作用于大量分割得很细的具有随机取向的晶体(粉末)上。在这样的随机取向徘布中有一些细小晶体具备满足布喇格关系式的取向。,由于反射光与入射光成角2,，,而2,角又绕着入射光随机取向，所以每一套反射平面的衍射极大都画出一锥面。因而，在与入射光垂直的感光底片上，衍射极大将显现为同心圆。被称为德拜谢乐(,Debye,-,Scherrer,),环的这些同圆，直接给出关于反射平面间距的信息。,45,(c)在一固定的单色X光中旋转一单晶，可使,角改变。从显现在环绕晶体的柱状感光底片上的衍射极大之间的距离，可以测定,。当底片以与晶体转动同步的周期来回运动时，则底片上衍射点的位置将直接指出晶体的取向。这一技术广泛地用于精确的结构测定。由于,值是固定的，各套反射平面间的距离即可确定，从而可以获得关于晶体结构的信息。另外，衍射点的强度也含有关于晶体精细结构的重要倍息。,46,3.米勒指数,为了确定晶体中不同的反射平面，建立了一套指数。这些指数称为米勒指数(Miller indices)，定义为平面截取单胞a、b、c轴的分数截距的例数。图3.7给出了立方晶体中的一些平面，说明米勒指数。平行于一个或两个轴的平面，其截距无穷大，因而米勒指数为0.,47,48,4.衍射花祥,当晶体在单色X光中绕平行于其单胞一边的轴旋转时，按式,反射的辐射必然画出一,sin,常数的圆锥。这些圆锥在包围晶体的圆柱状底片上就处于这样一些所谓的层线上，它们间的距离由下式给出,式中,x,是单胞轴的长度。因此，使晶体绕平行于单胞的一个轴(,a、b,或,c),旋转之后，测量层线距离，就可获得这些单胞轴的尺寸。,49,底片上衍射点之间的间距是由布喇格关系式决定的，并表明反射平面的距离,d,。,50,5.衍射极大的强度,在简单立方点阵的所有点上都有散射元素的结构。当入射角满足布喇格关系式时，自一个(100)面散射的单色X光将准确地与自后续的(100)面散射的X光同相。这是因为，所有的(100)面都包含结构的全部散射元素。对(110)面和(111)面也有同样的情况。,在体心结构中，(100)面并不包含结构的全部散射元素。因此，当X光以布喇格角入射时，(100)面的反射光彼此加强，而自其间平面反射的X光(它恰与其它平面的反射光有相位差)将减弱强度。,51,52,如果散射元素全都有相同的散射能力，最后的强度将减弱到0，而没有一级(100)衍射极大出现。但是，如散射元素是不同的，则一级(100)衍射极大将仍然表现出来，不过强度会减弱。体心结构的(110)面包含着全部散射元素，因而将出现一强的一级(110)衍射极大，二级反射在(100)面也将表现出强的衍射极大。这完全等价于(200)面的一级反射，在(200)面重又包含了结构的全部散射元素。,53,6.螺旋结构的衍射,衍射技术对螺旋结构的应用示于图3.10。图中的螺旋有螺距,a,每一螺距包含的散射元素为一整数(6)。由于含有散射元素的每个中介面都将产生一有1/6相位差的反射，所以一级(100)反射将为0(当每个散射元素有相等的散射能力时)。二级、三级、四级、五级(100)反射当然它们分别与一级(200)、(300)、(400)、(500)反射等价情况完全相同。,一级(600)反射则将表现出一强的衍射极大。当用矢量法表示时，这些情况可以图解得非常清楚。散射的射线有振幅和相位，因而可以用矢量来代表。,54,55,在图3.10所示螺旋的情况下，自每一散射元素来的矢量与前一散射元素的矢量有26的相位差，最后的衍射花样持如图3.11所示。,56,57,7.相位差,一个衍射极大的强度不仅由散射X线的振幅决定，而且也被它们的相位差决定。在实际晶体中，点阵点通常并不为单一的散射元素占据，而是被一组散射元素(实际是电子密度分布)占据。,例子：考虑一点阵中每个点被一黑一白两个原子替汉而成的结构(见图3.12a)。当单色x光以布喇格角射到一套平面上时，自所有黑原子产生的反射将是同相的，从全部白原子产生的反射也是同相的。但是，从黑原于来的射线与自白原子产生的射线稍有相位差，因而得到的衍射振幅将被干涉减弱(图3.12b)。,58,59,为求得相位差的一般表达方式，考虑一个二维截面。,黑原子置于单胞,a,与,b,边的拐角处，而白原子错开一个位置。取黑原子的坐标为(0，0)，白原子的坐标为(,x,，,y,)。一套满足布喇格条件的平面,hk,，其沿,a,的间距为,a/h,，沿,b,的间距为,b/k,，这相当于相位差为2弧度的位置、亦即从这些位置产生的散射是完全同相的。,这些平面与穿过白原子的那些平面间的相位差正比于白原子的位移量。,60,相位差的一般表达式,对于在,a,方向位移,x,的相位差,x,，由,或,给出。,a,方向和,b,方向都有位移的总相位差就是,推广到三维的情况,61,散射波的振幅,带有不同振幅和不同相位的波的叠加，用矢量加法最合适。如,f,1,和,f,2,，分别是原子1和2散射波的振幅，,1,和,2,是它们的相位，则其合振幅为,对单胞中的所有原子，上式变为,62,晶体的结构因子,由此得到，从(,hkl,)平面被单胞中所有原子散射波的合振幅,此量称为晶体的结构因子，它依赖于原子的位置和原子散射因子,f,j。,原子散射因子的值由散射角和原子中电子的数目及分布给出，正是晶体结构中的这些电子散射X光。,63,8.博里叶分析,被x射线分析考察的一个晶体可以看作电子密度的周期的三维分布,(xyz),，这样的密度分布可表达为傅里叶级数。,这里的傅里叶系数就是结构因子除以单胞的体积，即,加和是对所有,h,k,l,值进行，因而对每一套平面(,hkl,)，,亦即对,x,射线衍射花样上的每一个点，都有一项。该式概括了结构测定的全部问题。,64,9.相位问题,对于晶体结构，简单的来说，就是电子密度分布,(xyz),，所以单个原子的位置就是与原子序(电子数)成比例的高,(xyz),峰。,如果,F,(,hkl,)已知，则结构可以直接勾划出来。但问题在于，只能知道衍射点的强度，它仅与|,F,(,hkl,)|,2,成正比。,在获得x射线散射花样的过程中，知道了衍射波的振幅，但却失去了相位差。获得结构数据的唯一途径是，假设一试用结构并计算它所产生的衍射强度。,65,同晶置换,如果假想结构是近似正确的，则大多数观测反射的强度将与大量的计算强度相当。然后就可用,F,观测位和计算的(从假想结构)相位算出傅里叶级数，这样的博里叶加和将给出新的原子位置，由此又可计算新的,F,值，使其更多的相位得以正确决定。,有时也可通过将重原子引进晶体结构中的已知位置，使这一过称简化。,重原于对衍射的较大的贡献，使其有可能确定许多结构因子的相位。这一技术称为同晶置换。,66,尽管x射线结构分析包含大量冗长的工作，但还是有许多蛋白质的结构用这一方法的到了成功地阐明。,著名的成就有肌红蛋白(Kendrew)、血红蛋白(Perutz)和维生素B,12,(Hodgkin)的结构测定。,这一方法还以极为成功的方式被G ri ck和Watson以及Wilkins用以发现了DNA的双螺旋结构，结果使遗传的分子机理得到了阐明。,67,