qPCR技术概述.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,RNA,提取和荧光定量概述,邮箱：,haoxddong,电话：,18710280840,2025/4/28 周一,1,1,目录,第一部分：,RNA,提取,RNA,的重要性,RNA,提取的方法,RNA,质量的鉴定,第二部分：荧光定量,荧光定量的原理和方法,荧光定量的应用,市场上常见的荧光定量产品,2025/4/28 周一,2,2,2025/4/28 周一,3,从,RNA,开始到基因拷贝数的定量或者表达研究，已经成为大多数实验的主流设计方案，也是,RNA,相关课题研究的首选思路。,完整,RNA,的提取和纯化,是进行,RNA,方面的研究工作,如,Nothern,杂交、,RNA,芯片，,mRNA,分离、,RT-PCR,、定量,PCR,、,cDNA,合成及体外翻译等的前提。,1.,RNA提取的重要性,3,2025/4/28 周一,4,1.,RNA提取的重要性,4,2,.,RNA提取方法,2025/4/28 周一,5,细胞内的大部分,RNA,是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取,RNA,时要利用高浓度的蛋白质变性剂（,SDS,、胍盐等,),迅速破坏细胞结构，抑制,RNA,酶的活性，使核蛋白与,RNA,分离，释放出,RNA,。,通过有机溶剂（酚、氯仿 等）处理可以使,RNA,与其他细胞组分分离，得到纯化的总,RNA,。,5,2,.,RNA提取方法,2025/4/28 周一,6,欲提取,RNA,的样本,释放出,RNA,得到纯化的总,RNA,对,RNA,保存,异硫氰酸胍，胍盐/-巯基乙醇等，对细胞进行裂解,有机溶剂或硅基质吸附等方法对RNA,进行纯化,6,2.RNA提取方法,样品准备,2025/4/28 周一,7,样本最好用新鲜或者速冻,(,不能未经液氮速冻而直接保存于,-70,冰箱中,),的没有经过反复冻融的样本。,样品预处理方式：不同来源的样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织、细胞等）因细胞结果不同预处理方式亦有所不同。,一般处理方式如下：,植物材料,液氮研磨,动物材料,匀浆,(,液氮条件下,),、液氮研磨,细菌,溶菌酶破壁,7,2.RNA提取方法,细胞裂解,异硫氰酸胍,/,苯酚法（,TRIzol,法,）,:,TRIzol,方法，,Invitrogen,公司最先开发，应用于大部分动植物材料，但对次生代谢较多的植物材料，,RNA,提取效果较差。,异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将,RNA,释放到溶液中。,而酸性苯酚可促使,RNA,进入水相，离心后可形成,水相和有机层，这样,RNA,与仍留在有机相中的蛋,白质和,DNA,分离开。水相层（无色）主要为,RNA,，,有机层（黄色）主要为,DNA,和蛋白质。,2025/4/28 周一,8,基因组DNA,水相,有机相,RNA,8,2.RNA提取方法,细胞裂解,胍盐,/,-巯基乙醇法：,Qiagen,公司最先开发,此方法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。,胍盐使细胞充分裂解，-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程可以抑制,RNase,的活性，保护,RNA,不被降解,2025/4/28 周一,9,9,2.RNA提取方法,细胞裂解,2025/4/28 周一,10,其他方法：,有些植物材料多糖多酚，如植物果实，番茄叶子等；有些植物木质化程度较高，如根茎等组织，这些都会导致,RNA,提取过程的困难。如：,纤维组织（心脏，骨骼肌等）由于这些组织细胞密度低，单位重量组织中,RNA,含量低，所以需要增加起始量。,蛋白,/,脂肪含量高的组织（脑，油菜，菜籽等）如果抽提后上清含白色絮状物，需要重新抽提。,10,2.,RNA提取方法,纯化,2025/4/28 周一,11,纯化原则：,消除,RNA,样品中存在的对酶（如逆转录 酶）有抑制效应的有机溶剂和高亮度的金属离子。,避免其它生物大分子如蛋白质、多糖、脂类分子的污染。,排除,DNA,分子的污染,11,2.RNA提取方法,纯化,有机溶剂抽提法,抽提：常用氯仿，以去除蔗糖、蛋白等杂质,沉淀：用异丙醇或乙醇来沉淀水相中的,RNA,洗涤：,75%,的乙醇洗涤，去除盐离子,溶解：加入适量的,RNase-free ddH,2,O,2025/4/28 周一,12,12,2.RNA提取原理,纯化,硅基质吸附法,利用核酸与硅基质材在高盐条件下结合，低盐条件下脱离的特征。,2025/4/28 周一,13,13,3.RNA评价与鉴定,提取,RNA,后我们需要对,RNA,进行相关的质量检测，以确定它是否符合后续试验的要求。,RNA,用于不同的后续试验，对其质量要求不尽相同。如：,cDNA,文库构建：要求,RNA,完整，且无酶抑制物残留,Northern blot,：对,RNA,的完整性要求高,RT-PCR:,对酶反应抑制物残留要求严格,2025/4/28 周一,14,14,3.RNA评价与鉴定,RNA,纯度检测,分光光度计法,通过,OD260/280,来检测,RNA,的纯度，,OD260/230,作为参考,OD260/280,在,1.9-2.1,之间，可以认为,RNA,的纯度较好；,OD260/280,小于,1.8,，则表明蛋白质杂质较多；,OD260/280,大于,2.2,，则表明,RNA,已经降解；,OD260/230,小于,2.0,，表明裂解液中有异硫氰酸胍和,-,疏基乙醇的残留。,2025/4/28 周一,15,15,3.RNA评价与鉴定,rRNA,占总,RNA,的,80%-85%,，在琼脂糖凝胶上可以清晰的看到,28S(23S),和,18S,（,16S,）,rRNA,。当,28S rRNA,的量约为,18S rRNA,的两倍的 时候，说明,RNA,的完整性较好,2025/4/28 周一,16,RNA,完整性鉴定,琼脂糖凝胶电泳,16,第二部分：实时荧光定量PCR,2025/4/28 周一,17,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个,PCR,进程，,最后通过标准曲线和,C,T,值对未知模板进行定量分析的方法。,17,1,.,qPCR原理和方法,2025/4/28 周一,18,实时荧光定量,PCR,是,1996,年由,Applied Biosysrems,公司推出的实验技术；,常用的荧光标记方法：,1,，非特异性荧光标记（染料法）：,1,、,SYBR Green,2,、,EvaGreen 3,、,LC Green,2,，特异性荧光标记（探针法）：,1,、,TaqMan 2,、,Molecular Beacon 3,、,Amplisensor,18,1.qPCR原理和方法,SYBRB Green,基本原理,:,SYBR Green I,是一种结合于所有,DNA,双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。只有和双链,DNA,结合后才发荧光，当,DNA,双链分开，无荧光。,2025/4/28 周一,19,SYBR Green,19,SYBR GREEN,法优缺点,优点：,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,缺点：,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性（但可以通过,溶解曲线,的分析优化反应条件）,对引物特异性要求较高,2025/4/28 周一,20,1.qPCR原理和方法,SYBRB Green,20,1,.,qPCR原理和方法,SYBR Green熔解曲线分析,利用荧光染料可以指示双链,DNA,熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。,2025/4/28 周一,21,SYBR GREEN,熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。,(-dI/dT),融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确,21,1,.,qPCR原理和方法,SYBR Green 熔解曲线分析,2025/4/28 周一,22,1,，融解曲线分析，有杂峰；,2,，其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确。,22,1,.,qPCR原理和方法,Taq man探针法,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,5,3,外切核酸酶活性，可水解探针,2025/4/28 周一,23,23,1,.,qPCR原理和方法,Taq man探针法,2025/4/28 周一,24,24,1,.,qPCR原理和方法,Taq man探针法,2025/4/28 周一,25,Taq man,探针法优缺点：,优点：,对目标序列高特异性,-,阴性结果确定,设计相对简单,-,与目标序列某一区域互补,重复性比较好,缺点：,只适合一个特定的目标,价格较高,不容易找到本底低的探针,25,1,.,qPCR原理和方法,Molecular Beacon 分子信标,2025/4/28 周一,26,分子信标是一段荧光标记、具有茎环发夹结构的寡聚核苷酸探针,环两端各有,5-6,个核苷酸配对形成茎环结构，,5,端报告基团，,3,端淬灭基团,在,PCR,反应的退火,/,延伸阶段，分子信标与靶序列特异结合，分子信标由发夹结构变为链状结构,26,1,.,qPCR原理和方法,Taq man探针法,2025/4/28 周一,27,Taq man,探针法优缺点：,优点：,对目标序列高特异性,检测,SNP,最灵敏的试剂之一。,荧光背景低,缺点：,只适合一个特定的目标,价格较高,不容易找到本底低的探针,27,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,28,28,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,29,Fluores cence,29,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,30,Ct,值的定义：,C,T,值：,C,代表,Cycle,，,T,代表阈值,(threshold),，,C,T,值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,C,T,值由阈值确定,30,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,31,阈值,(threshold),缺省值设定为基线（,baseline,，即本底信号）范围,(3-15,个循环,),内荧光信号强度标准偏差的,10,倍。,阀值由基线确定,31,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,32,理想的,PCR,反应,:,X,n,X,0,*2,n,X,n,：第,n,次循环后扩增产物数量,X,0,：起始模板数量,n,：,扩增循环数,32,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,33,非理想的,PCR,反应,:,X,n,X,0,*(1+E,n,),n,Xn,：第,n,次循环后扩增产物数量,X,0,：起始模板数量,n,：扩增循环数,E,n,:,扩增效率,33,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,34,在扩增产物达到阈值线时,:,X,Ct,=X,0,(,1,+E,x,),Ct,=M,-(1),X,Ct,：,荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,.,在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为,M,方程式,(1),两边同时取对数得,:,lg M=lg X,0,(,1,+E,x,),*,Ct,-(2),整理方程式,(2),得,:,lg,X0,=-,Ct,lg(,1,+Ex)+lg M,-(3),扩增产物的对数与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。,34,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,2025/4/28 周一,35,荧光强度,-,循环数曲线,初始模板量对数,-C(T),循环数标准曲线,10,4,10,3,10,6,10,5,10,2,10,浓度的对数值,与,循环数,呈,线性关系,，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,35,2,.,qPCR原理和方法,定量原理,绝对定量,目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。,相对定量,不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方法是通过稀释目的基因的,PCR,产物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。,2025/4/28 周一,36,36,绝对定量,2025/4/28 周一,37,敏感性高,:,检测低拷贝数样品,;,区分小差异样品,大范围拷贝数样品,同时检测,:10,0,10,10,省时有效,临床检测，,转基因检测,环境监测等,37,标准曲线法相对定量举例,2025/4/28 周一,38,38,标准曲线法相对定量举例,2025/4/28 周一,39,设置内标：,b-,actin,、,GAPDH,等管家基因,对靶基因进行均一化：靶基因拷贝每一个内标基因拷贝,双标准曲线法,含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线；,样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理，,标本间靶基因的表达水平分析,2,-c(t),法,标本内靶基因与内标基因,Ct,值比较：,C(t)=C(t)m-,C(t)n,标本间,C(t),比较：,c(t),C(t)1,-,C(t),2,-c(t),计算,39,标准曲线法相对定量举例,2025/4/28 周一,40,40,标准曲线法相对定量举例,2025/4/28 周一,41,41,3,.,qPCR的应用,1，定量分析2，定性分析,2025/4/28 周一,42,42,3,.,qPCR的应用,定量分析,绝对定量分析：,DNA,或,RNA,的绝对定量分析,病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植拷贝数的检测，,RNAi,基因失活率的检测等。,相对定量分析：,基因表达差异分析,比较经过不同处理样本之间特定基因的表达，,特定基因在不同时相的表达差异,cDNA,芯片或差显结果的确证,2025/4/28 周一,43,43,3,.,qPCR的应用,定性分析,定性分析：,利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；,利用特异性探针进行基因型分析及,SNP,检测、甲基化检测等。,随着实时荧光定量,PCR,技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用,2025/4/28 周一,44,44,谢谢大家！,2025/4/28 周一,45,45,