免疫组库测序.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,IR-SEQ,1,目录,免疫组库（,IR,）,免疫组库测序技术,信息分析,2,1,、免疫组库概念,免疫组库,（,Immune Repertoire,，,IR,）,是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性,B,细胞和,T,细胞的总和。研究免疫组库就要测定免疫系统中的,BCR,和,TCR,的基因或,RNA,分子序列。,影响免疫组库组成的因素有很多种。比如年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。,3,根据淋巴细胞,DNA,来源的不同，对于免疫组库的研究分为以下几大类健康人士一般采用抽取,外周血,的方式；特殊人群比如白血病人或者白血病细胞微小残留病（,MRD,）患者，为了深入研究其免疫组库的变化也将,骨髓血,作为淋巴细胞,DNA,的来源；刚出生的婴儿，其,脐带血,可以用于研究人在出生早期与母亲在免疫组库方面的联系与区别；而对于动物来说尤其是小型动物，,脾脏,也是常见淋巴细胞的,DNA,来源脏器。,以,唾液和尿液,作为淋巴细胞,DNA,来源的方式。,4,2,、,BCR,B,细胞受体（,BCR,）又称为免疫球蛋白（,IG,），它是由,B,细胞分泌的可以和抗原结合的蛋白质分子。成熟的,B,细胞可以将,IG,分泌到细胞外面以中和抗原。免疫球蛋白由两条重链（,heavy chain,H,），两条轻链（,light chain,L,）中间通过二硫键连接而成。重链（,IGH,）由,Variable,（,V,），,Diversity,（,D,），,Joining,（,J,）和,Constant,（,C,）,基因片段重组而来；轻链（,IGL,）只由,V-J-C,重组,而来。重链（,H,链）又分为,V,区、,C,区、跨膜区及胞质区；而轻链（,L,链）则只有,V,区和,C,区。,V,区由,VH,和,VL,两个结构域组成，各有,3,个,CDR,即,CDR1,、,CDR2,和,CDR3,。,5,决定,B,淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具,多样性的重链,CDR3,区,，其多样性的产生源于,IGHV,（,51,个功能性基因片段）末端,-IGHD(23,个功能性基因片段）,-IGHJ,前端（,6,个功能性基因片段）基因重排及,V-D,和,D-J,连接时,非模板依赖性核苷酸插入或剪切,和体细胞高频突变等。,6,3,、,TCR,T,细胞受（,TCR,）是由,T,细胞分泌的膜蛋白分子，与,BCR,不同的是,TCR,只在细胞表面而不分泌出去。一个,T,细胞的,TCR,可以是,链和,链组成的，或者由,链和,链组成的。,链和,链由,V-J-C,基因片段重组而来，,链和,链由,V-D-J-C,基因片段重组而来，这也类似于,BCR,的重链和轻链,。,参与特异性免疫应答的,T,淋巴细胞主要是,/T,淋巴细胞，占外周淋巴细胞的,90-95%,。,TCR,链,CDR3,在抗原特异性识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点,，其编码基因位于人类,7,号染色体（,7q34,），全长,620kb,，由,50,多个可变区（,V,区）基因片段、,2,组上游,D,基因片段,/,下游恒定区（,C,区）基因片段、,67,个,J,区基因片段组成，这些基因在,T,淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始,T,细胞阶段，,D-J,区片段连接为,DJ,片段；在成熟,T,淋巴细胞阶段，,V,、,D,、,J,、,C,区基因片段相连成,VDJC,片段。,7,据推测，胚系,VDJC,基因片段随机组合、重排以及,TCR/,链和,/,链,V,区基因重排产生的,TCR,克隆数量高达,10,15,-10,18,，构成多样性极其丰富的,T,淋巴细胞抗原受体库。不同,T,淋巴细胞克隆有不同序列或长度的,TCR-CDR3,基因，翻译出不同的,CDR3,多肽序列，从而反映,T,淋巴细胞功能状态。,在发生特异性免疫应答时，,TCR,多样性发生变化，出现寡克隆甚至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始,T,淋巴细胞增殖，,TCR,免疫组库多样性得以恢复和重建。,8,不同,VDJ,基因片段组合的多样化；,不同基因片段连接时随机插入删除造成连接的多样化，,V(D)J,连接区核苷酸的插入和删除，体现为互补决定区簇,CDR3),序列多样性,；,不同重链和轻链组合的多样化；,以及,B,细胞受体特有的随机高频突变。,4,、,BCR/TCR,多样性产生机制,9,5,、,研究免疫组库的流程,提取样本,DNA/RNA:,根据所要研究的问题设计试验方案，提取血液或组织样本，分离,B,细胞或,T,细胞，然后提取和纯化,DNA/RNA,。,构建测序文库,:,根据不同实验情况加入不同扩增引物进行,PCR,扩增，从而扩增出想要测序的免疫基因，最后构建测序文库。,测序,:,利用二代高通量测序仪，如,Roche 454,、,Illumina Hi Seq2500,、,Illumina Mi Seq,等进行测序。,信息分析,:,对测出来的序列数据进行信息挖掘，来发掘出生物学意义与结果。数据分析主要包括数据清理、质量控制、不同样本数据分离、序列比对、序列注释以及下游的各种分析。,10,11,二、免疫组库测序,12,1,、免疫组库测序概念,免疫组库测序（,Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ),）是以,T/B,淋巴细胞为研究目标，用,多重,PCR,技术,或,5RACE,扩增决定,B,细胞受体（,BCR,）或,T,细胞受体（,TCR,）多样性的互补决定区（,CDR3,区），,再结合高通量测序技术,（,HTS,）,，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。,13,2,、两种,PCR技术的优缺点,14,Arm-PCR,是最新开创的一种高效扩增子救援多重,PCR,，它克服了传统多重,PCR,的缺限。通过在扩增的早期使用基因靶点特异性的引物，而在指数扩增期使用共用的引物，使得所有模板的扩增效率大大提高，因而具有较高的特异性和灵敏性,。,15,3,、模板比较,基因组虽然,DNA,容易制备，但,PCR,扩增过程中易产生非产出性的重组序列，且,J-C,区之间存在的大量内含子使其下游引物只能位于,J,区，,PCR,扩增的敏感性一般由细胞的拷贝量决定；相对而言，,RNA,需取自,新鲜的标本,，其产物多为产出性的,CDR3,序列，下游引物可选自,C,区，具有高度的敏感性。,16,4,、主流测序技术及优缺点,17,免疫组库分析的精确性依赖于,HTS,数据的可靠性。而,HTS,数据的可靠性又依赖于测序的准确性和覆盖的深度。,18,Thermo,测序平台,Ion Torrent,:,革新性的半导体芯片测序技术平台,原理是：向 DNA 聚合物中加入 dNTP，会释放出氢离子。我们采用半导体测定这些氢离子引起的 pH 变化，通过同时测量数百万起此类变化，可以测定各个片段的序列。,高效靶向覆盖-运用多重PCR设计实现平均97%靶向覆盖,读长-可选择200bp或400bp读长,19,5,、信息分析,1,、基本数据统计,数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量,reads,的处理,数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建,数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估,2,、数据比对分析,比对分析，与数据库（,IMGT,）,V/D/J,基因片段比对,重新比对，寻找最佳,V/D/J,比对结果,3,、序列结构分析,分析,CDR,序列组成及序列碱基成分,分析,CDR,序列的碱基插入和缺失,编码,CDR,序列翻译成氨基酸和肽链,20,4,、免疫组库构建,构建免疫组库表达谱，统计多样性抗体库克隆表达情况,免疫组库多样性呈现，绘制,V/J,基因表达的,2D,、,3D,图,5,、免疫组库差异分析,样品间多样性差异分析（辛普森系数、香农威纳系数）,样品间克隆表达差异分析（,CDR3,，,V-D-J,）,分组样品间的克隆表达差异分析（,CDR3,，,V-D-J,）,21,6,、,IR-SEQ,存在的,问题,1,、,构建免疫组库的过程实际上是基于多重引物,PCR,来覆盖,BCR,或,TCR,序列多样性的过程，这就会涉及多重引物之间扩增效率导致的偏好性的问题，一套好的多重引物总会平衡各对引物之间的扩增效率以及尽量避免引物间的非特异性扩增和二（多）聚体，可以说构建的免疫组库质量的好坏直接取决于其,多重引物质量的高低。,22,2,、,以人体内,BCR,为例，保守估计,BCR,的种类多样性在,10,11,这一数量级级别上，其中骨髓方面占,17%,，全身淋巴结占到,28%,，脾脏和粘膜系统占,23%,，外周血方面仅占,2%,，其他约占,30%,。然而我们对人免疫组库的研究往往是以来源方便的外周血，显然外周血对免疫组库多样性的贡献率,2%,远远不足，为了能尽量完全地反映人群的免疫组库全貌，我们可以通过增加样本量的方式来弥补单个人外周血免疫组库不能反映免疫组库全貌的不足，但是巨大的样本量又让人望而却步。,23,3,、,免疫组库的多重引物并不通用,，每个物种甚至每个种系的引物都可能不尽相同。这意味着每研究一种新的物种的免疫组库，我们都要重新设计合成该物种的多重引物以及,PCR,条件等。另一反面，有的物种胚系基因序列不全甚至没有，这也给多重引物的设计带来一定的麻烦。,24,