检测牛腺病毒的试剂盒及其应用发明专利.doc

检测牛腺病毒的试剂盒及其应用发明专利
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检测牛腺病毒的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测各血清型 牛腺病毒的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用 该靶序列进行牛腺病毒检测的方法和试剂盒。
背景技术
牛腺病毒(Bovineadenovirus,BAV)属腺病毒科哺乳动物腺病 毒属，为双链DNA病毒，可导致牛犊的呼吸道、消化道感染。BAV 的感染较为普遍，许多国家从病牛及外表健康的犊牛的分泌物及粪 便中分开发现，BAV不仅感染牛，还能使羊和鹿发病。BAV分为两 个群，9个血清型，其中血清3型的感染较为普遍，研究最多。牛血 清是生物制品行业不可缺少的原材料，外源因子的污染严重影响生 物制品的质量，因此，对生物制品中牛病毒的检测非常重要，其中 包括对牛腺病毒的检测。
目前生物制品行业各生产厂家普遍采纳细胞培养法，血吸附法， 免疫荧光法进行检测，但这些方法存在敏感度低，检测周期长，检 测精度低，结果判定易受多种因素影响，客观性不够，劳作量大等 问题；常规PCR检测法虽然敏感性、稳定性、特异性较好，但容易 污染，造成假阳性结果；已有的荧光定量PCR法虽然克服了上述方 法的缺陷，但是仅能检测牛腺病毒3型，具有检测的局限性，并且 仅能够进行牛腺病毒的定性检测，无法定量，检测特异性、灵敏度 检测范围等参数均未通过验证。因此迫切必须要一种能够同时检测各血 清型的牛腺病毒的方法，以降低生物制品企业的生产成本，提升企 业经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测各血清型牛腺病毒的特异、灵 敏、快速、简便的方法以及检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明通过对NCBI数据库已报道的牛腺病 毒基因序列比对，搜索到牛腺病毒3型全基因序列，序列号为 AF030154.1，GI:2935210，使用NCBI在线BLAST中的conserved domains分析功能，基因组606-1348bp为保守区基因序列E1A，该 序列在牛腺病毒所有血清型中高度保守，找到了牛腺病毒各血清型 特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该靶序 列是检测各血清型牛腺病毒的遗传标记物。此外，本领域技术人员 应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测牛腺病毒的遗传标 记物。该基因组保守区的遗传标志物在牛腺病毒各个血清型中高度 同源，本发明依据该保守序列，通过反复对比、筛选，制定了用于 检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。本发明引物和探针不但 适用于3型牛腺病毒的检测，还适用目前已知的其他8个血清型牛 腺病毒的检测。
在本发明的一个实施方式中，优选的特异性引物对的序列为：
上游引物序列为：5'-GAAGAGGATGAGTGTCTGAATGC-3'
下游引物序列为：5'-TCTATCCACGGTTCTGGAGACAT-3'
荧光探针序列为：
(FAM)5’-CTGTTTCCTGATCCCTGGCTAAATGCAG-3’(TAMR A)。
本发明提供了在制备检测牛腺病毒试剂盒中的应用。
进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。
含有上述特异性引物对的试剂盒，可通过一般PCR方法实现对 各血清型牛腺病毒的特异、快速检测，当扩增的目的条带为120bp 左右时(如图1所示)，将PCR扩增产物进行基因测序，并将测序 结果与该保守区基因序列(SEQIDNO.4)进行同源性比对，假设与该 保守区基因序列一致(如图2所示)，则说明待测样品含有牛腺病毒。
含有上述特异性引物对的试剂盒，可通过SYBRGreen法荧光 定量PCR实现对各血清型牛腺病毒的特异、快速检测。
在本发明的一个实施例中，SYBRGreen法荧光定量PCR检测 牛腺病毒的50μl反应体系为：反转录酶，2μl；扩增酶和底物混合 物，25μl；10μM上、下游引物，各2μl；ROXDyeⅡ，1μl；Rnase freeddH2O，14μl，病毒基因组模板：4μl。然后采纳AB7500荧光 定量PCR仪进行PCR反应，设置SYBRGreen荧光信号采集条件， 循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性10sec，1个循环；95℃变 性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)，40个循环；熔解 曲线分析，95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec(收集荧光信号)。 依据标准品扩增结果建立定量检测标准曲线。阳性组扩增曲线的CT 值应小于30，熔解曲线峰形单一，且熔解曲线峰值高于80℃，证实 引物特异性较好，无非特异性扩增；阴性对照组和空白对照组扩增 曲线CT值均大于30，熔解曲线出现双峰且峰值低于80℃，则为阴 性扩增。
进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对和荧光探针的 试剂盒。
含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒可通过Taqman法 荧光定量PCR实现对各血清型牛腺病毒的特异、快速检测。
具体地，该试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，对待测样本提取 基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的 特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量 PCR，检测待测样本中的牛腺病毒。
在本发明的另一个实施例中，Taqman法荧光定量PCR检测牛腺病 毒的50μl反应体系为：反转录酶，2μl；扩增酶和底物混合物，25μl； 10μM上、下游引物，各1μl；10uM荧光探针，2μl；ROXDyeⅡ，1μl； RnasefreeddH2O，14μl；病毒基因组模板，4μl。然后采纳AB7500 荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置5’端FAM荧光信号采集，3’端 TAMRA荧光信号采集，循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性 10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)， 40个循环，建立定量检测标准曲线，依据样品扩增曲线判定结果。
在对照有效扩增的状况下，样品检测结果可信，否则试验必须要重 复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果推断标准如下：
Ct值小于40的标本为阳性结果；
Ct值大于40或无CT值的标本为阴性结果；
Ct值在35-40之间的标本必须要重复，重复试验如Ct值依旧低于40 判定为阳性扩增，超过40或无CT值判定为阴性扩增。
本发明提供了上述两种试剂盒在生物制品质量检测中的应用。
本发明提供了一种检测生物制品中牛腺病毒的方法，对待测生 物制品样本提取基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQ IDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行 Taqman荧光定量PCR，检测待测生物制品样本中的牛腺病毒；
或对待测生物制品样本提取基因组DNA后以其为模板，利用 SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对进行SYBRGreen 荧光定量PCR，检测待测生物制品样本中的牛腺病毒。
本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳 性模板所述阴性模板为无菌水，所述阳性模板为牛腺病毒基因组 DNA。
本发明对基于上述两种荧光定量PCR方法的试剂盒的检测灵敏 度进行了研究：实验发现采纳本发明的特异性引物对和/或探针运用 Taqman荧光定量PCR和SYBRGreen荧光定量PCR检测牛腺病毒， 检测范围为102-108拷贝/μl，灵敏度均能达到102拷贝/μl。
现有技术中采纳SYBRGreen法荧光定量PCR检测牛腺病毒的特 异性较差，检测时常有非特异性扩增，由引物二聚体、引物发卡结构 等造成，容易造成假阳性，无法确保检测的准确性。本发明所制定引 物经一般PCR检测，无引物二聚体等结构。进行SYBRGreen法荧光 定量PCR、Taqman法荧光定量PCR检测应均无非特异性扩增，证实本 发明的引物和探针具有很好的特异性。此外采纳本发明的引物和探针 检测其他几种牛病毒和无菌水，均无检出目的信号，证实本发明的引 物和探针具有基因模板特异性、牛腺病毒检测的特异性。
本发明依据牛腺病毒基因组保守区序列制定通用引物和探针，该 基因组保守区在牛腺病毒各个血清型中高度同源，因此本发明引物和 探针可以检测牛腺病毒所有血清型；且通过牛腺病毒基因组制备标准 品，建立标准曲线，可以进行牛腺病毒基因组的定量检测，检测范围、 灵敏度、特异性、专属性均经过验证；本发明制定的引物进行SYBR Green法荧光定量PCR，极大的缩减了检测成本，同时也能确保较好 的特异性和灵敏度；本发明制定的引物和探针的组合也可进行 Taqman法荧光定量PCR，均可以达到同样的检测效果，克服了现有方 法的缺陷，不但适用于3型牛腺病毒的检测，还适用目前已知的其他8 个血清型牛腺病毒的检测，极大地降低了检测成本，提升了检测效率。
基于本发明的技术方案，本发明至少取得以下优异效果：
(1)广谱性：与其他荧光定量PCR检测方法相比，克服了同类技 术只能检测牛腺病毒3型的局限性，本发明可以对牛腺病毒所有血清 型进行检测，极大的提升了该技术的检测效率和使用范围。
(2)特异性：采纳本发明制定的引物(或引物和探针组合)分别 进行一般PCR，SYBRGreen法荧光定量PCR、Taqman法荧光定量PCR 检测牛腺病毒，均无非特异性扩增。说明本发明制定的引物具有较好 的特异性，可以应用于不同的PCR检测方法中，并且可以达到相同的 检测效果。采纳本发明制定的引物扩增其他病毒：牛细小病毒、牛副 流感病毒、牛腹泻病毒、呼肠孤病毒时，均无非特异性扩增，说明本 发明制定的引物具有非常好的病毒检测特异性。
(3)灵敏度更高、检测范围更广：本发明对灵敏度和检测范围进 行了验证，牛腺病毒基因组的检测范围能够达到108-102拷贝/μl，102拷贝/μl的病毒模板即可检测出。
(4)定量检测：相比同类技术仅可进行牛腺病毒的定性检测，本 发明通过牛腺病毒基因组标准品构建标准曲线，R2能够达到0.999， 可以进行牛腺病毒基因拷贝数的定量检测，检测结果准确。
(5)节省成本：现有荧光定量PCR检测牛腺病毒，为了加强特异 性，通常采纳Taqman法荧光定量PCR，但制定探针的费用昂贵。本发 明制定的引物可以进行SYBRGreen法荧光定量PCR，不必须要荧光探 针，省去了制定探针的高昂费用，更为经济节约，且能够达到与 Taqman法荧光定量PCR相同的检测效果。如有必须要，采纳本发明的引 物和探针组合，也可进行Taqman法荧光定量PCR，使用者可以依据自 身经济状况进行自主选择合适的方法。
附图说明
图1为采纳本发明的引物对的一般PCR检测牛腺病毒电泳结果 图。其中，泳道1为DNAMarker，泳道2为模板为牛腺病毒基因组 的PCR检测结果，泳道3-5分别为模板为牛细小病毒、牛副流感病 毒、无菌水的PCR检测结果。
图2为采纳本发明的引物对的一般PCR检测牛腺病毒后阳性结 果的测序结果图。
图3为本发明SYBRGreen法荧光定量PCR方法的标准品不同 浓度的扩增曲线。其中，1、2、3、4、5、6、7分别为浓度108、107、 106、105、104、103、102拷贝/ul标准品扩增曲线。
图4为本发明SYBRGreen法荧光定量PCR方法的标准曲线图。
图5A和5B为本发明SYBRGreen法荧光定量PCR方法引物特 异性验证的扩增曲线图，图5C和5D分别为5A和5B对应的熔解 曲线图。图5A中，1为牛腺病毒扩增曲线，2、3分别为牛细小病毒、 牛副流感病毒扩增曲线。图5B中，1为牛腺病毒扩增曲线，4为水 的扩增曲线。5C中，1为牛腺病毒熔解曲线，2、3分别为牛细小病 毒、牛副流感病毒熔解曲线。图5D中，1为牛腺病毒熔解曲线，4 为水的熔解曲线。
图6为本发明Taqman荧光定量PCR方法的标准品不同浓度的 扩增曲线。其中，1、2、3、4、5、6、7分别为浓度108、107、106、 105、104、103、102拷贝/μl标准品扩增曲线。
图7为本发明Taqman荧光定量PCR方法的标准曲线图。
图8为本发明Taqman荧光定量PCR方法的扩增曲线图。其中， 1为牛腺病毒扩增曲线，2、3、4分别为牛细小病毒、牛副流感病毒、 水的扩增曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的状况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
假设未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。本发明实施例采纳AllprepDNA/RNAMiniKit (QIAGEN)提取牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腹泻 病毒、呼肠孤病毒的基因组，提取方法采纳试剂盒推举步骤。
实施例1牛腺病毒保守序列的选择与特异性引物的制定
通过对NCBI数据库已报道的牛腺病毒基因序列比对，搜索到 牛腺病毒3型全基因序列，序列号为AF030154.1，GI:2935210，使 用NCBI在线BLAST中的conserveddomains分析功能，基因组 606-1348bp为保守区基因序列E1A，该序列在牛腺病毒所有血清型 中高度保守，找到了牛腺病毒各血清型特异性的保守靶序列，其核 苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该靶序列是检测各血清型牛腺病毒 的遗传标记物。该基因组保守区的遗传标志物在牛腺病毒各个血清 型中高度同源，本发明依据该保守序列，通过反复对比、筛选，设 计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。本发明引物和 探针不但适用于3型牛腺病毒的检测，还适用目前已知的其他8个 血清型牛腺病毒的检测。
本发明的引物制定遵循以下原则：避免引物自身或之间形成4个 以上连续配对，无环状发卡结构；18-24bp长；Tm值55-65℃，GC含 量在40％-60％之间，两个引物Tm值相差不超过2℃；3’端不出现A， 且不出现三个或三个以上连续相同碱基；引物后5个核苷酸不能有超 过2个G和C；扩增片段长度在50-150bp最正确。
本发明探针制定遵循以下原则：尽量靠近上游引物；长度20-30 bp；检测折叠和二级结构；Tm值65-70℃，GC含量40％-70％，5’端无 G，C含量高于G；
本发明通过筛选获得的用于扩增牛腺病毒各血清型特异性的保 守靶序列的特异性引物对的序列为：
上游引物序列为：5'-GAAGAGGATGAGTGTCTGAATGC-3'(SEQ IDNO.1)
下游引物序列为：5'-TCTATCCACGGTTCTGGAGACAT-3'(SEQ IDNO.2)
特异性探针序列为：
5’-CTGTTTCCTGATCCCTGGCTAAATGCAG-3’。(SEQID NO.3)，标记探针的荧光标记为5’端FAM，3’端TAMRA。
实施例2采纳本发明的特异性引物对进行牛腺病毒的一般PCR检 测
采纳病毒基因组提取试剂盒进行牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流 感病毒基因组的提取，提取方法参照试剂盒推举步骤。以实施例1的 特异性引物对为上下游引物，对上述样品的基因组进行PCR扩增。
首先配制PCR反应体系：反转录后病毒基因组模板1.5μl，上下 游引物各1μl，双蒸水9μl，TaqMix酶混合物(强欣博瑞EP0301)12.5 μl，共25μl。然后采纳Bio-RadMyCyclerPCR仪进行PCR反应，反 应程序设置：94℃：2min，1个循环；94℃：30sec，60℃：30sec，30 个循环；4℃储存。最后采纳1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳 结果如图1所示。由结果可知，仅牛腺病毒有扩增，且扩增条带清楚 且单一，其他牛病毒均无扩增，说明引物特异性好。
将PCR产物进行测序，将测序结果与目的序列进行Blast比对，基 因同源性为100％，比对结果如图2所示。证实扩增产物即为目的序列， 本发明实施例1的特异性引物对具有较好的特异性。
实施例3SYBRGreen法荧光定量PCR检测牛腺病毒
1、基因组标准品的制备：
提取牛腺病毒总DNA，采纳分光光度计测定OD260，牛腺病毒为 双链DNA，将核酸浓度换算为核酸拷贝数，推算公式如下：1A260吸 光光度值＝dsDNA50ug/m核酸浓度＝OD260×稀释倍数×50，拷贝数 计算公式＝6.02×1023(拷贝数/mol)×浓度(g/ul)/平均分子量(g/mol)。 依据核酸浓度换算为核酸拷贝数为5.5×108拷贝/μl，将病毒基因组进 行连续10倍梯度稀释，稀释浓度分别为108、107、106、105、104、103、 102拷贝/μl，-20℃储存备用。
2、SYBRGreen法荧光定量PCR：
以牛腺病毒基因组为模板作为阳性实验组，以牛细小病毒、牛副 流感病毒基因组为模板作为阴性对照组，以水代替模板作为空白对照 组。采纳实施例1的特异性引物对和本发明试剂盒所带试剂进行检测。 首先配制反应体系：每个样品检测体系为50μl，其中反转录酶，2μ l；扩增酶和底物混合物，25μl；10uM上游引物，2μl；10uM下游引 物，2μl；ROXDyeⅡ，1μl；RnasefreeddH2O，14μl，各病毒基 因组：4μl。然后采纳AB7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置 SYBRGreen荧光信号采集条件，循环程序：42℃反转录5min，95℃ 预变性10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧 光信号)，40个循环；熔解曲线分析，95℃，15sec；60℃，1min； 95℃，15sec(收集荧光信号)。
3、建立定量检测标准曲线：
由结果可知，标准品不同浓度的扩增曲线之间平行性和间隔较好 (如图3所示)，以起始模板对数为横坐标，每个浓度模板的扩增曲 线CT值为纵坐标制作标准曲线(如图4所示)。模板7个稀释度的CT 值呈优良的线性关系，R2＝0.999，检测范围为108-102拷贝/μl，灵敏 度最高能达到102拷贝/μl。
4、特异性验证结果：
经扩增曲线(如图5A和图5B所示)和熔解曲线(如图5C和5D所 示)结果可知，牛腺病毒基因组检测CT值为12.712，熔解曲线峰值为 81.5℃，为阳性扩增，且熔解曲线峰形单一，证实无非特异性扩增。 牛细小病毒、牛副流感病毒、水的扩增曲线CT值均大于30，熔解曲 线峰值在75℃左右，均为阴性扩增。结果证实本发明的引物有较好的 模板特异性。
实施例4Taqman法荧光定量PCR检测牛腺病毒
1、特异性引物和探针制定：
采纳实施例1中制定的特异性引物对和荧光探针对牛腺病毒实现 定量检测，引物和探针均由华大基因合成。
2、基因组标准品制备参见实施例3。
3、Taqman法荧光定量PCR
以牛腺病毒基因组为模板作为阳性实验组，以牛细小病毒、牛副 流感病毒基因组为模板作为阴性对照组，以水代替模板作为空白对照 组。采纳本发明实施例1的引物、探针和本发明试剂盒所带试剂进行 检测。首先配制反应体系：每个样品的PCR反应体系为50μl，其中反 转录酶2μl；扩增酶和底物混合物，25ul；10uM上游引物，1μl； 10μM下游引物，1μl；10μM荧光探针，2μl；ROXDyeⅡ，1μl； RnasefreeddH2O，14μl；各病毒基因组模板，4μl。然后采纳AB7500 荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置5’端FAM荧光信号采集，3’端 TAMRA荧光信号采集，循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性 10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)， 40个循环后反应结束。
3、建立定量检测标准曲线：
不同浓度模板扩增曲线之间平行性和间隔较好(如图6所示)， 以起始模板对数为横坐标，每个浓度模板扩增曲线CT值为纵坐标制 作标准曲线(如图7所示)。模板7个稀释度的CT值呈优良的线性关 系，R2＝0.999，检测范围为108-102拷贝/μl，灵敏度最高能达到102拷 贝/μl。
4、特异性验证结果：
经扩增曲线(如图8所示)结果可知，阴性对照组和空白对照组 无扩增曲线，说明其他病毒扩增结果均为阴性，阳性组扩增曲线CT 值22，为阳性扩增。由此可见，本发明的引物和探针均有较好的模板 特异性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改善，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改善，均属于本发明要求保护的范围。